摘要
目的：研究黄芪桂枝五物汤对糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症大鼠的治疗作用及其机制。方法：将48只健康雄性SD 大鼠随机分为模型组、低剂量中药组、高剂量中药组和空白对照组，每组12只，低剂量中药组和高剂量中药组分别给予1倍和2倍等效剂量中药汤剂灌胃，模型组和空白对照组给予生理盐水灌胃，连续干预4周。末次给药后24h ，观察大鼠一般情况、体质量、血糖水平，酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子−α(TNF−α)、白细胞介素-16(IL-16)、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)水平，观察腓肠肌新生血管密度，HE染色观察动脉血管病理变化，免疫印迹法检测缺氧诱导因子−1α(HIF−1α)/血管内皮生长因子(VEGF)通路蛋白表达水平。结果:低剂量中药组、高剂量中药组及模型组大鼠较空白对照组精神状态差，活跃性减弱，血糖升高，血清炎症因子水平升高，血管内皮功能受损。与模型组比较，低剂量中药组大鼠精神状态更好，行动较活跃，血糖下降，血清炎症因子水平降低，内皮细胞功能更完善，腓肠肌组织新生血管密度更高，HIF−1α及VEGF蛋白表达水平更高(P<0.05)。与低剂量中药组比较，高剂量中药组大鼠血糖下降，血清炎症因子水平降低，NO水平无显著差异，ET-1水平下降，腓肠肌组织新生血管密度更高，VEGF蛋白表达水平更高(P<0.05)。结论：黄芪桂枝五物汤可能通过调节HIF-1α/VEGF信号通路而抑制局部炎症反应，改善内皮细胞功能，从而起到治疗糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症的作用。
Abstract
Objective To observe the therapeutic mechanism of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on diabetic lower extremity arteriosclerosis obliterans in rats. Methods A total of 48 experimental rats were randomly assigned to four groups: model, low-dose traditional Chinese medicine, high-dose traditional Chinese medicine, and blank control, each consisting of 12 rats. The low -dose and high -dose traditional Chinese medicine groups received 1 and 2 times equivalent doses of traditional Chinese medicine decoction by gavage, respectively, whereas the model and blank control groups got normal saline by gavage for 4 weeks. The rats’ overall conditions, body weight, and blood glucose levels were assessed 24 hours after their previous injection.Serum levels of TNF -α, IL-16, NO and ET-1 were measured using ELISA. We assessed the density of new blood vessels in the gastrocnemius muscle, examined arterial pathological alterations using HE staining, and detected protein expression levels of the HIF −1α/VEGF pathway using Western blotting. Results In comparison to the blank control group, rats in the low-dose Chinese medicine group, high-dose Chinese medicine group, and model group had a lower mental state, decreased activity, increased blood sugar, elevated serum inflammatory markers, and impaired vascular endothelial function. Compared to the model group, rats in the low-dose Chinese medicine group had better mental state, more active actions, lower blood sugar, lower serum inflammatory factors, more perfect endothelial cell function, higher density of new blood vessels in gastrocnemius, and higher expression levels of HIF-1α and VEGF proteins (P<0.05). Compared to the low -dose Chinese medicine group, the high -dose Chinese medicine group showed lower blood sugar, serum inflammatory markers, NO level, ET-1 level, higher density of new blood vessels in gastrocnemius, and higher expression level of VEGF protein (P<0.05). Conclusion Huangqi Guizhi Wuwu decoction may help cure diabetic arteriosclerosis obliterans in the lower limbs by modulating the HIF -1α/VEGF signal pathway, decreasing local inflammation, and increasing endothelial cell function.
糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症（diabetic lower limb arteriosclerosis obliterans，DLASO）是糖尿病患者常见的大血管并发症，糖尿病与下肢动脉闭塞同时出现，即可诊断为此病[1]。DLASO 在我国发病广泛，且发病率与患者年龄呈正相关[2]，是导致老年糖尿病患者下肢溃疡与截肢的重要因素，还可增加患者发生心脑血管疾病的风险[3-4]，从而严重影响患者日常生活。
DLASO属于中医“脱疽"范畴，常因寒凝血瘀致脉络痹阻，黄芪桂枝五物汤源自《金匮要略》，原方主治血痹病，具有益气温经以及和血通痹的效果[5]。本课题组对中医经典方剂进行研究及总结长期临床经验的基础上，运用黄芪桂枝五物汤治疗DLASO 取得了较好的疗效。为进一步明确黄芪桂枝五物汤治疗DLASO的作用机制，本研究通过观察黄芪桂枝五物汤对DLASO大鼠炎症因子水平、血管内皮功能、血管新生情况的影响以及缺氧诱导因子−1α（HIF-1α）/血管内皮生长因子（VEGF）通路蛋白表达水平的差异，探讨黄芪桂枝五物汤治疗DLASO 的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
健康雄性SD大鼠由黑龙江中医药大学动物安全性评价中心提供[生产许可证号：SCXK（黑）2019-004，动物质量合格证号：20220521]，6~8周龄，体质量200~250g。所有大鼠在光照/黑暗12h/12h，湿度40%~70%，室温环境下饲养。本研究按照《实验动物管理条例》具体规定进行实验（伦理审查编号：2022B076）。
1.1.2 实验药物与主要仪器
黄芪桂枝五物汤由黑龙江中医药大学附属第一医院提供，药物组成：黄芪30g，桂枝30g，芍药30g，生姜20g，大枣10g（中药均购自黑龙江德顺长中药饮片有限公司）。HE染色液（上海莼试生物技术有限公司，CSBR3592）；ELISA试剂盒（上海百生跃生物科技有限公司；BR2001457-96T）；免疫组化检测试剂盒（上海西格生物科技有限公司，XG-X10910）；兔源抗大鼠抗-GAPDH、抗-VEGF及抗-CD31抗体（英国Abcam公司，ab224004、ab51874、ab218582）。
显微镜（日本Olympus公司，CX43）；超薄石蜡切片机（上海宇北医疗器械有限公司，KD-P）；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，5720110011）；垂直蛋白电泳仪（美国Hoefer公司，DYCZ-25DN）；蛋白转印仪（美国Bio-Rad公司，1704150）；动物血糖测试仪（上海玉研科学仪器有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制备与分组
采用高脂高糖饮食+链脲佐菌素（STZ）构建大鼠糖尿病模型[6]，大鼠以耳标号法标记，造模大鼠使用高脂高糖饲料（饲料组成：10%猪油，2.5%胆固醇，20%蔗糖，1%胆酸盐，66.5%普通饲料）喂养2周后，自腹腔注射2% STZ（25mg/kg），继续高脂高糖饲料喂养1周后，取尾静脉血检测大鼠空腹血糖，血糖值≥16.7mmol/L 为糖尿病模型构建成功。腹腔注射2%戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉，消毒左后肢皮肤，分离并暴露大鼠股动脉，结扎股动脉根部，剥离股动脉3个分支并结扎，构建糖尿病大鼠下肢动脉硬化闭塞模型[7]。本研究实验动物共48只，随机分为模型组、低剂量中药组、高剂量中药组及空白对照组，每组12只，低剂量中药组和高剂量中药组造模后分别给予1倍和2倍等效剂量中药汤剂灌胃，模型组造模后予生理盐水灌胃，空白对照组给予普通饲料喂养2周后，腹腔注射同等剂量（25mg/kg）柠檬酸钠缓冲液，不进行下肢动脉结扎。
1.2.2 给药
低剂量中药组及高剂量中药组大鼠灌胃黄芪桂枝五物汤汤剂，每剂药液中的药物含量通过人体与大鼠质量比例换算（黄芪桂枝五物汤单剂质量120g，人体质量60kg，配制中药汤剂浓度为1g/mL，换算系数为6.25），大鼠每天用药剂量：120/60×6.25=12.5g/kg，低剂量中药组给予1倍等效剂量，高剂量中药组给予2倍等效剂量，2次/d。空白对照组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃，2次/d，连续干预4周。实验期间所有大鼠均自由活动与进食饮水。
1.3 指标检测
1.3.1 一般情况、体质量与血糖检测
观察大鼠一般状态，包括毛色、皮温、活动灵敏度等，并在用药前后测量大鼠体质量。血糖检测：大鼠禁食8h，用乙醚麻醉大鼠，75%酒精棉球消毒大鼠眼周，无菌采血针刺人大鼠目内静脉丛约1mm，待血液流出，将血糖仪试纸末端接触血液，等待读数。
1.3.2 ELISA法检测大鼠血清炎症因子水平
末次给药结束后24h，自腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉大鼠后，腹主动脉采血，离心机在4℃ 以4000r/min 速度离心10min 后，取上清液，根据ELISA试剂盒说明检测各个样本的白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平。
1.3.3 ELISA法检测大鼠血清血管内皮细胞功能指标水平
同1.3.2取大鼠血清，采用ELISA试剂盒检测各个样本的一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）水平。
1.3.4 免疫组化检测大鼠腓肠肌组织新生血管密度
分离大鼠手术侧腓肠肌组织，包埋制成石蜡切片（5μm），经过脱蜡、抗原修复后，使用羊血清封闭液封闭组织切片。加人稀释100倍的一抗，4℃ 孵育过夜，滴加稀释200倍的二抗后，在37℃ 温箱孵育30min，DAB显色、苏木素复染，经脱水、透明、封片后，置于显微镜下观察，每张切片随机选取3个高倍视野（×200）计数，以单个或条索状CD31阳性血管内皮细胞记录为一个血管，以血管数与视野下切片面积相除，将观察结果转换为血管密度。
1.3.5 大鼠动脉血管组织病理学观察
取造模大鼠缺血动脉血管组织，经脱水、包埋、切片（5μm）脱蜡后，反向梯度乙醇处理，染色5min，自来水浸洗，返蓝液返蓝15s，伊红染色，脱水，透明，封片，镜检。
1.3.6 免疫印迹法检测HIF−1α/VEGF 通路蛋白表达水平
同1.3.5步骤取血管组织，沸水浴加热变性蛋白后，每组各取15μg，120V 恒压下电泳分离后，电转所得膜浸人5%脱脂奶粉溶液封闭，剪下HIF-1α、VEGF、GAPDH的蛋白条带，采用相对应稀释1000倍的一抗、稀释2000倍的二抗对上述各组蛋白进行抗原抗体反应，通过化学发光法显色后摄取各组蛋白图像。拍照后以 Image-Pro plus 软件定量其灰度值，统计分析后得到其相对表达水平。
1.4 统计学方法
使用SPSS 24.0进行数据分析，本实验数据均为计量资料，以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行组间比较，方差齐性检验采用Levene 检验，方差齐时组间进一步两两比较采用LSD-t法，方差不齐采用Dummett's T3 法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况及体质量、血糖
空白对照组大鼠精神状态良好，活动灵敏，进食自如，毛色正常有光泽，饮水量与尿量均正常。模型组大鼠整体精神萎靡，活动度差，毛色发黄，色泽暗淡，反应迟钝，饮水量及尿量明显增加；高剂量中药组与低剂量中药组大鼠整体精神状态好于模型组，精神状态欠佳，反应减退，尿量与饮水量增加。
各组大鼠治疗前体质量差异无统计学意义；治疗后各组大鼠体质量比较:模型组、低剂量中药组及高剂量中药组大鼠体质量均低于空白对照组（P<0.01），低剂量中药组及高剂量中药组大鼠体质量均高于模型组（P<0.01），见图1。
治疗后血糖比较结果：造模组大鼠空腹血糖均高于空白对照组（P<0.01），低剂量中药组及高剂量中药组大鼠空腹血糖均低于模型组，且高剂量中药组大鼠空腹血糖低于低剂量中药组（P<0.05），见图1。
图1各组大鼠给药前后体质量及空腹血糖值比较
2.2 各组大鼠血清TNF−α，IL−6含量比较
模型组、低剂量中药组及高剂量中药组大鼠TNF−α、IL-6 水平均高于空白对照组（P<0.05），低剂量中药组大鼠TNF−α，IL−6水平低于模型组（P<0.05），高剂量中药组大鼠TNF-α、IL-6水平低于低剂量中药组（P<0.05），见表1。
表1各组大鼠血清TNF-α、IL-6含量比较
注：a与空白对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与低剂量中药组比较，P<0.05
2.3 各组大鼠血清 NO、ET-1 含量比较
模型组、低剂量中药组及高剂量中药组NO水平均低于空白对照组（P<0.01），低剂量中药组及高剂量中药组大鼠 NO 水平均高于模型组，高剂量中药组与低剂量中药组大鼠NO差异无统计学意义。模型组及低剂量中药组ET-1水平均高于空白对照组（P<0.05），低剂量中药组及高剂量中药组大鼠ET-1水平均低于模型组（P<0.05），高剂量中药组大鼠ET-1水平低于低剂量中药组（P<0.05），见表2。
表2各组大鼠血清NO、ET-1含量比较
注:a与空白对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与低剂量中药组比较，P<0.05
2.4 各组大鼠排肠肌血管密度
显微镜下可见大鼠下肢腓肠肌组织中CD31标记血管，计算各视野下血管密度，结果显示，模型组大鼠血管密度低于空白对照组（P<0.05），低剂量中药组和高剂量中药组大鼠血管密度较模型组升高（P<0.05），高剂量中药组大鼠血管密度高于低剂量中药组组（P<0.05）见表3、图2。
表3各组大鼠腓肠肌组织血管密度比较
注：a与空白对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与低剂量中药组比较，P<0.05
图2各组大鼠腓肠肌组织CD31表达（×200）
2.5 动脉血管病理学观察情况
空白对照组大鼠动脉内膜细胞增生，血管内壁见炎性细胞浸润，细胞外基质增加，模型组大鼠动脉血管组织存在明显损伤，表现为内皮结构受损，大量炎性细胞浸润，平滑肌细胞排列紊乱等。相较于模型组大鼠，低剂量中药组及高剂量中药组大鼠动脉血管组织损伤较轻，细胞结构完整，排列整齐，见图3。
图3各组大鼠动脉血管组织HE染色（×200）
2.6 HIF-1α/VEGF通路蛋白表达情况
模型组大鼠动脉组织HIF−1α和VEGF蛋白表达较空白对照组降低（P<0.05）；低剂量中药组及高剂量中药组大鼠动脉组织HIF−1α和VEGF蛋白表达均较模型组升高（P<0.05）；高剂量中药组大鼠动脉组织中VEGF蛋白表达水平高于低剂量中药组（P<0.05）见表5、图4。
表5各组大鼠动脉组织HIF-1α、VEGF蛋白相对表达量比较
注：a与空白对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与低剂量中药组比较，P<0.05
图4各组大鼠动脉组织 HIF-1α、VEGF蛋白表达
3 讨论
DLSAO为临床常见缺血性疾病，下肢血管的修复和重建在其治疗过程中具有重要意义。研究表明，新生血管的生成主要由缺氧诱导，其过程与HIF-1α/VEGF信号通路密切相关[8-9]。糖尿病患者体内的高糖环境会降低HIF−1α及VEGF的基因表达，从而损伤信号通路，影响病理状态下血管新生，进而使得 DLSAO 患者伤口难以愈合[10]。因此，恢复DLSAO患者被损伤的HIF−1α/VEGF 信号通路可以有效改善其体内HIF−1α及VEGF的表达水平，从而起到促进血管生成的作用，最终加快患者创面愈合速度[11]。
黄芪桂枝五物汤为东汉张仲景所制经典方剂，常用于缺血性疾病的治疗，对糖尿病并发症有较好的疗效[12-13]。方中黄芪益气助阳为君，桂枝温通经脉为臣，芍药收敛阴血，并能缓急止痛，生姜散风寒、通痹阻，大枣补中气，诸药共奏温经通脉，益气养血之效。黄芪桂枝五物汤含多种抗氧化成分，如黄芪多糖和黄酮类化合物，可清除体内过量的自由基，降低氧化应激水平，保护细胞免受氧化损伤。研究发现，黄芪桂枝五物汤方剂能够扩张血管，增加血流量，从而改善局部组织的血供，促进DLSAO患者的康复[14]。
动脉硬化闭塞模型构建以动脉环缩或结扎最为常用，其机制是通过阻断下肢供血使实验动物肢体缺血。本研究通过高糖高脂饮食构建大鼠糖尿病模型，以血管结扎方式构建动脉硬化闭塞模型，结果显示，造模大鼠血糖升高，大鼠血清炎症因子ⅡL-6、TNF−α水平升高，血管内皮细胞功能指标NO水平降低，ET-1水平升高，血管组织出现病理性损伤，表明DLSAO大鼠模型构建成功。各造模组大鼠治疗前血糖均≥16.7mmol/L，治疗后，低剂量中药组和高剂量中药组大鼠血糖值较模型组低，表明黄芪桂枝五物汤有一定的降低血糖作用。
动脉硬化是一个慢性损伤过程，涉及血管壁的内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞等多种细胞类型，炎症因子不仅参与动脉粥样硬化的形成，还与疾病的严重程度和预后密切相关[15]。TNF-α、IL-6等通过激活血管内皮细胞，导致内皮细胞表达黏附分子和促凝血因子，增强血液中细胞与内皮细胞的相互作用，最终促进了血栓的形成。本研究通过比较治疗后炎症因子TNF−α、IL−6水平，观察到黄芪桂枝五物汤有明显的抗炎作用，低剂量中药组和高剂量中药组的大鼠炎症因子水平均较模型组更低。HE 染色结果显示，低剂量中药组和高剂量中药组大鼠动脉组织炎性细胞浸润均有所减轻。ET-1和NO水平是反映内皮细胞受损和内皮功能的细胞标志物[16]。本研究结果显示，低剂量中药组和高剂量中药组大鼠 NO 水平均较模型组更高，ET-1水平均较模型组低，且高剂量中药组的差异更显著，表明高剂量中药组大鼠血管内皮细胞损伤更轻，内皮细胞功能更完备。HIF−1α、VEGF蛋白表达水平差异反映各组大鼠下肢血管生成和修复差异，低剂量中药组和高剂量中药组的大鼠蛋白表达水平均高于模型组，表明黄芪桂枝五物汤对糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症大鼠缺血下肢有促进血管生成，改善下肢供血的作用。
综上所述，黄芪桂枝五物汤可能通过调节大鼠HIF-1α/VEGF信号通路，抑制局部炎症反应，改善内皮细胞功能，从而促进糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症大鼠血管新生，起到治疗作用。