摘要
目的：探讨清胰汤联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)对重症急性胰腺炎肺损伤(SAPALI)肺气血屏障的保护作用。方法：用3.5%牛磺胆酸钠逆行注射大鼠胆胰管建立SAPALI模型。将50只雄性大鼠均分为假手术组、模型组、清胰汤组、BMSCs 组及清胰汤联合BMSCs 组。HE染色检测胰腺和肺组织损伤。ELISA法检测大鼠血清脂肪酶、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6表达水平。免疫组化检测肺氧化应激相关指标髓过氧化物酶(MPO)和 4-羟基壬烯酸(4-HNE)水平变化。使用免疫荧光分析和Westerm Blotting 检测肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞的表达水平。结果：清胰汤能显著改善重症急性胰腺炎(SAP)引起的肺微环境损伤。与BMSCs组相比，联合使用BMSCs可下调TNF-α、IL-6在肺泡灌洗液中的表达以及肺组织中MPO 和 4-HNE的表达，提示清胰汤能够促进BMSCs修复肺气血屏障。清胰汤和BMSCs 联合治疗增加了SAPALI大鼠肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞的表达。结论:清胰汤联合BMSCs 可通过降低炎症反应和氧化应激水平来促进SAPALI肺气血屏障的修复。
Abstract
Objective To explore the protective effect of Qingyi decoction combined with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on the lung air-blood barrier in severe acute pancreatitis lung injury (SAPALI).Methods The SAPALI model was established by retrograde injection of 3.5% sodium taurocholate into the bile and pancreatic ducts of rats. Fifty male rats were evenly divided into sham operation group, model group, Qingyi decoction group, BMSCs group and Qingyi decoction combined with BMSCs group. HE staining detects pancreatic and lung tissue damage. ELISA was used to detect the expression levels of serum lipase, TNF−αand IL-6.Immunohistochemistry was used to detect changes in levels of lung oxidative stress -related indicators myeloperoxidase (MPO) and 4-hydroxynonenoic acid (4-HNE). Immunofluorescence analysis and Western Blotting were used to detect the expression levels of alveolar epithelial cells and microvascular endothelial cells. Results Qingyi decoction can significantly improve the pulmonary microenvironment caused by severe acute pancreatitis.Compared with the BMSCs group, combined use of BMSCs can down-regulate the expression of TNF-αand IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid as well as the expression of MPO and 4-HNE in lung tissue. The above results suggest that Qingyi decoction can promote BMSCs to repair the lung air-blood barrier. Combined treatment with Qingyi decoction and BMSCs increased the expression of alveolar epithelial cells and pulmonary microvascular endothelial cells in SAPALI. Conclusion Qingyi decoction combined with BMSCs can promote the repair of lung air-blood barrier in SAPALI by reducing the level of inflammatory response and oxidative stress.
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是临床上常见的危重症之一，发病急骤、病情凶险，死亡率可高达13%~35%[1]。而重症急性胰腺炎肺损伤（severe acute pancreatitis lung injury，SAPALI）是SAP最常见、最严重的并发症，约60%的SAP患者入院后1周内死于呼吸功能衰竭。在SAP 的发展过程中，胰腺的局部炎症和被破坏的肠道屏障功能可引起进展的全身性炎症反应[2]。这些诱发炎性风暴的因子聚集在肺部，可导致肺泡上皮细胞与肺微血管内皮细胞坏死脱落。富含蛋白的水肿液渗人并积聚在肺间质和肺泡腔，造成肺气血屏障损伤，并引发急性肺水肿、肺不张和肺通气功能障碍。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，能够再生、替代、修复和分化受损细胞[3]。大量研究表明BMSCs能够修复损伤肺气血屏障，在急性肺损伤模型中显示出良好的治疗前景。有文献报道，不同程度肺损伤微环境会影响 BMSCs的存活及治疗效果[4-5]。清胰汤是我国经多年临床实践和动物实验证实可治疗急性胰腺炎及相关脏器损伤的标准中药方剂[6-7]。本课题组前期研究结果显示，SAP 中胰腺的局部炎症和肠道屏障破坏导致炎症随全身蔓延，并随着血液流向肺部，炎症条件下BMSCs 的存活率明显降低，而清胰汤可以抑制胰酶活化、中和内毒素，减少肠源性内毒素和细菌移位；可以减轻胰腺、肺组织等重要器官的过氧化损伤并抑制炎症反应，还可以改善损伤脏器的微环境[8-10]。本研究探讨了清胰汤通过改善SAPALI肺内微环境，协同 BMSCs修复肺气血屏障结构和功能的效果，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD 健康大鼠50只，雄性，体质量（200±20）g，饲养于无病原体室，采用标准饲料分笼饲养，自由进食和饮水，室内温度（22±2）℃、湿度（45±5）%，光照时间为12h/12h 明暗交替。所有实验均按照大连医科大学研究与动物伦理委员会批准的实验方案进行（批准号：AEE19003）。
1.2 主要药物
方剂清胰汤（组成:大黄、芒硝、柴胡、木香、白芍、黄芩、栀子、元胡）购置于大连医科大学附属第一医院中药药剂科，配置清胰汤终浓度至1g/L。BMSCs购于中国科学院细胞库，培养至P4代，用于大鼠尾静脉注射治疗。
1.3 实验试剂
牛磺胆酸钠（北京索莱宝科技有限公司）、大鼠脂肪酶（南京建成生物工程研究所）；白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）−α的ELISA 试剂盒（上海西唐生物科技有限公司），抗体 AQP5、SPC（Proteintech 公司），β-actin（Abclonal Biotech 公司），HRP偶联山羊抗兔IgG （Abbkine公司），大鼠髓过氧化物酶（MPO）抗体（Abcam公司），4-羟基壬烯醛（4-HNE）抗体（Bioss 公司），BCA定量试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司），免疫荧光核染色剂DAPI（北京索莱宝生物技术公司）。
1.4 分组、造模及给药
将大鼠适应性喂养1周后造模，造模前12h 禁食水。大鼠随机分为假手术组、模型组、清胰汤组、BMSCs组和清胰汤联合BMSCs 组，每组10只。其中，假手术组大鼠开腹后仅翻动胰腺数次后关腹。模型组采用经胰胆管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠的方法建立SAP大鼠模型。清胰汤组于造模后4h、12h、18h、26h、34h、42h 灌胃清胰汤剂（3.51g/kg），其他各组大鼠在同一时间进行等体积无菌生理盐水灌胃。BMSCs组于术后4h经尾静脉注人BMSCs（1×106个），其他各组在同一时间注射等体积无菌PBS缓冲液。清胰汤联合BMSCs 组在灌胃清胰汤剂的同时自尾静脉注射BMSCs（1×106个）。所有动物于造模48h 后取材。
1.5 观察指标
1.5.1 胰腺和肺组织形态学
各组大鼠胰腺和肺组织在4%多聚甲醛中固定24h 后进行石蜡包埋，切成4μm 切片用 HE 染色并进行病理评分。胰腺通过以下4个参数进行评分，每个参数的评分为0~3分:1）腺泡坏死（0分：无，1分:<15%坏死面积；2分：15%~35%坏死面积；3分：>35%坏死面积）。2）炎症细胞浸润（0分：无；1分：轻度血管周围浸润；2分：中度血管周围和轻度弥漫性浸润；3分：大量弥漫性浸润）。3）出血（0分:无；1分:1~2个出血灶；2分：3~5个出血灶；3分：每张载玻片>5个出血灶）。4）水肿（0分：无；1分：片状叶间隙增宽；2分：弥漫性叶间隙增宽；3分：弥漫性腺泡间隙增宽）。肺组织以肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润和出血3个参数进行评分，每个参数的评分为0~3分：1）0分：正常肺；2）1分:<25%肺部受累；3）2分：25%~50%肺部受累；3分：50%~75%肺部受累。
1.5.2 ELISA法检测血清IL-6以及肺泡灌洗液（BALF）中 TNF-α和IL-6水平
采用ELISA试剂盒，按说明书操作检测血清中的IL-6以及BALF中的TNF-α和IL−6水平，以标准品8000、4000、2000，1000，500，250，125，0 pg/mL 为横坐标，光密度（OD）值为纵坐标，绘制标准曲线，计算出待测样本的含量。
1.5.3 肺组织湿/干重比值（W/D）测定肺组织含水量
取大鼠右肺上叶于预先称重的小皿中，称取湿重量，随后将小血放置60℃ 烘箱烘干48h，再次称其干重量，用W/D评价肺组织水肿情况。
1.5.4 免疫荧光检测肺泡I型上皮细胞AQP5和肺泡Ⅱ型上皮细胞 SPC 的表达
按照 HE 染色所述方法制备切片。将切片与SPC 和AQP5一抗在4℃孵育过夜，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤 3次后，将切片与Alexa-488、Alexa-568偶联的二抗在黑暗中孵育30min。细胞核在黑暗中用4'，6-二胖基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5min。共聚焦显微镜观察肺泡I型上皮细胞 AQP5 和肺泡Ⅱ型上皮细胞 SPC 的表达情况和共定位情况。
1.5.5 Western Blotting检测肺组织中SPC、AQP5及β-actin 蛋白的表达水平
用裂解缓冲液从组织中提取总蛋白，使用BCA定量试剂盒对蛋白质浓度进行定量。加入蛋白质样品，进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉将膜在室温下封闭2h，然后在4℃下与AQP5、SPC一抗孵育过夜。在TBST缓冲液中洗涤3次后，并与对应的二抗在37℃ 下孵育1h。电化学发光显影，内参定量分析。
1.5.6 血清脂肪酶表达情况
采用南京建成脂肪酶试剂盒测定大鼠血清脂肪酶含量（组成：底物缓冲液、Tris 缓冲液和生理盐水等）。
1.5.7 免疫组织化学检测肺组织MPO和4-HNE 的表达
取肺组织样品，石蜡包埋4μm 厚度切片，分析肺组织中MPO和4-HNE表达。在光学显微镜下观察切片，并使用Image J软件进行分析。
1.5.8 BCA 法检测BALF中总蛋白表达
无菌生理盐水灌洗左肺3次，取上层澄清BALF，用BCA 定量试剂盒测定总蛋白含量。
1.5.9 伊文思蓝渗透实验测定肺组织微血管内皮通透性
通过伊文思蓝染料可以与血液中的白蛋白相结合的特性，二者相互结合后在629nm 激发光作用下发出红色荧光，通过测定各组吸光度评估大鼠肺血管通透性。
1.6 统计学分析
使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用LSD-t 检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SAPALI肺部微环境改变
HE染色结果显示，与假手术组相比，模型组胰腺和肺坏死、炎症浸润、出血水肿等表现更严重；血清脂肪酶水平明显升高；血清炎症因子IL-6水平及肺组织湿干重比值升高。经清胰汤或BMSCs治疗后，上述表现有适当缓解，而二者联合应用后，治疗效果明显改善。提示清胰汤可以帮助BMSCs改善SAPALI的肺部微环境，见图1。
图1清胰汤改善SAP导致的肺部微环境
2.2 肺气血屏障的修复有所改善
肺泡灌洗液中，模型组TNF-α、IL-6表达水平明显高于假手术组，清胰汤辅助BMSCs治疗后，相较于单独使用清胰汤或BMSCs治疗，炎症因子TNF-α、IL-6的表达明显降低。肺组织中MPO及4-HNE免疫组织化学分析显示，清胰汤联合BMSCs治疗明显降低了肺部氧化应激水平。与清胰汤组相比，清胰汤联合BMSCs明显降低了BALF中 MPO及4-HNE蛋白表达水平，见图2。
图2清胰汤促进BMSCs肺气血屏障修复功能
2.3 肺泡上皮细胞表达和肺毛细血管通透性改变情况
模型组AQP5和 SPC 的荧光表达减弱，经清胰汤联合BMSCs治疗后，二者表达明显增加，Western Blotting检测也显示清胰汤联合BMSCs治疗能够上调 SAP所致的AQP5和 SPC 表达下降。伊文思蓝渗透实验显示清胰汤联合BMSCs治疗明显增加了肺毛细血管的通透性，见图3。
3 讨论
本研究结果显示清胰汤联合应用BMSCs促进了肺气血屏障的恢复；相对于单独应用干细胞，联合清胰汤应用可以更好地改善肺微环境。可能得益于清胰汤有效抑制过度的炎症反应，减少过氧化损伤，改善BMSCs的生存微环境，二者协同促进肺气血屏障尤其是促进肺泡上皮细胞和内皮细胞修复，从而有效地治疗SAPALI。
BMSCs属于中胚层的一类多功能干细胞，拥有其他干细胞无法比拟的优势，不会受到伦理方面的束缚，目前已成为理想的细胞治疗、组织工程和基因治疗的靶细胞或多功能“种子细胞”，尤其在急性肺损伤中具有广泛的应用前景。Thomas等[5]在文献中报道，不同程度急性呼吸窘迫综合征微环境会影响间充质干细胞（MSCs）线粒体转移的效果。另有文献报道，患有肺曲霉感染的囊性纤维化患者的支气管肺泡灌洗液对MSCs可迅速产生毒性，这可能与真菌产物胶质毒素有关[11]，以上均表明，在必要时及在进行MSC治疗之前可能需要对微环境进行“矫正”，更有利于对疾病的治疗。
既往研究结果提示SAPALI微环境复杂，存在过度的炎症反应、过氧化反应，这些因素均不利于干细胞的生存并影响其发挥作用[12]。SAP 诱发的全身炎症反应能使中性粒细胞聚集在肺泡周围，导致中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶和组蛋白的释放增加[13]，导致肺泡上皮细胞与肺微血管内皮细胞坏死脱落，肺气血屏障被破坏。本研究结果提示，SAPALI发生期间BALF中蛋白表达增高，TNF−α、IL-6等炎症因子以及MPO、4-HNE过氧化因子明显升高。
图3清胰汤联合BMSCs治疗增加APALI肺泡上皮细胞及微血管内皮细胞表达
清胰汤最早源自《伤寒论》，由治疗阳明腑实证的经典方大承气汤加味而成，是中西医结合治疗急性胰腺炎的经验方剂。课题组前期构建了SAP诱导急性肺损伤大鼠模型，给予清胰汤干预，并进行了肺组织蛋白质组学分析。测序结果显示，差异性蛋白主要富集在趋化因子信号通路、凋亡、白细胞跨内皮迁移和局灶性黏附等信号通路。可见，清胰汤对APALI的治疗作用可能是通过改善肺部微环境发挥的综合效应。同时，本研究结果也提示，清胰汤治疗可以明显减少胰腺和肺组织损伤及全身炎症反应。与单独应用清胰汤或BMSCs相比，清胰汤联合BMSCs更明显地降低了BALF中TNF-α、IL-6水平，减少了BALF蛋白渗漏以及肺组织中MPO、4-HNE表达以及伊文思蓝外渗。二者联合应用明显上调AQP5和SPC的表达，提示清胰汤联合BMSCs 改善肺气血屏障可能与二者协同促进肺泡上皮细胞的修复有关。
本研究显示，清胰汤可以通过抑制全身及肺组织局部炎症反应及过氧化损伤等作用改善肺组织的局部微环境，为BMSCs发挥作用创造良好条件；另一方面，清胰汤与BMSCs协同促进肺气血屏障结构和功能的恢复，从而改善SAP时的肺功能，但具体机制仍有待进一步阐明。
综上所述，清胰汤与BMSCs联合应用可以改善SAPALI肺气血屏障功能的恢复。与单独使用清胰汤或BMSCs相比，BMSCs联合清胰汤可以改善肺炎性过氧化微环境，协同促进BMSCs对肺组织的再生和修复。本研究的初步结果为中药联合BMSCs治疗 SAPALI提供了进一步的证据，为干细胞治疗SAPALI提供了新的策略。
