摘要
目的：研究血必净对脓毒症相关性血小板减少症（TCP）大鼠模型的肝脏是否具有保护作用。方法：选取雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠40只，随机均分为4组，假手术（Sham）组、盲肠结扎穿孔模型（CLP）组、血必净治疗（XBJ）组和血必净提前干预（pre-XBJ）组，每组各10只。CLP组、XBJ组和pre-XBJ组实施盲肠结扎穿孔术诱导脓毒症TCP模型，Sham组开腹不结扎穿孔；术前，pre-XBJ组给予尾静脉注射血必净，Sham组、CLP组、XBJ组给予等体积生理盐水；术后0 h、12 h，给予XBJ组尾静脉注射血必净，其余各组给予等体积生理盐水；术后24 h，自大鼠眼球采血检测血小板计数，酶联免疫吸附法（ELISA）检测肝功能相关指标、炎症因子水平；HE染色观察肝损伤及免疫组织化学检测肝脏中血小板滞留情况。结果：CLP组大鼠血小板计数显著低于Sham组，而pre-XBJ组较CLP组血小板计数增加（P＜0.05）；XBJ组和pre-XBJ组丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TB）均较CLP组降低（P＜0.05），炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6和IL-18表达量减少（P＜0.05）；XBJ组和pre-XBJ组肺脏组织水肿、炎症细胞浸润及肝脏内血小板内滞留情况均较CLP组减轻。结论：血必净可缓解脓毒症TCP大鼠血小板计数减少，改善肝脏损伤及血小板在肝脏内聚集黏附，对脓毒症TCP大鼠肝脏有一定的保护作用。
Abstract
Objective To investigate the effect of Xuebijing on the liver injury in the septic thrombocytopenic rats. Methods Rats were randomly divided into four groups: control group (Sham), cecum ligation perforation model group (CLP), Xuebijing treatment group (XBJ) and Xuebijing prevent intervention group (pre-XBJ). The rats of CLP group，XBJ group and pre-XBJ group were performed cecal ligation and perforation to induce sepsis thrombocytopenia model and the Sham group rats were only opened without ligation and perforation. Before the operation, the pre-XBJ group rats were giving Xuebijing by tail vein injection and the other groups were giving equal volume of normal saline. The XBJ group rats were giving Xuebijing by tail vein injection at 0 h and 12 h after operation, and the other groups were given an equal volume of normal saline. Blood was collected from the abdominal aorta at the 24 h after operation to detect platelet counts, and ELISA was used to detect liver function related indicators, TNF-α and other inflammatory factors. HE staining was used to observe liver injury and immunohistochemistry to detect platelet retention in the liver. Results The platelet count of rats in the CLP group was significantly lower than that in the Sham group, while the platelet count of rats in the XBJ intervention groups increased than the CLP group（P＜0.05）. The AST，ALT and TB in the XBJ intervention groups were all lower than the CLP group（P＜0.05）, and the expression level of TNF-α, IL-6 and IL-18 were also reduced in the XBJ group and pre-XBJ group than that in the CLP group（P＜0.05）. The pulmonary tissue edema, inflammatory cell infiltration and platelet retention in the liver in the XBJ group and pre-XBJ group were all reduced compared with the CLP group. Conclusion Xuebijing can relieve the reduction of platelet count in septic thrombocytopenic rats, improve liver damage and platelet aggregation and adhesion in the liver, and has a certain protective effect on the liver of septic thrombocytopenic rats.
Keywords
脓毒症是由感染引起的机体反应失调而造成威胁生命的器官功能障碍[1]。血小板减少和肝脏损伤是脓毒症患者常见的并发症。肝脏作为人体重要的防御器官，在脓毒症的发展过程中扮演着重要的角色。脓毒症发生时机体内炎症因子大量激活和血小板的过度激活是引发多器官功能衰竭的重要因素，特别是血小板的过度激活[2-3]。异常活化的血小板聚集能力增强，与内皮细胞的黏附能力增强，通常会引发血管内微血栓的形成，其在肝脏内聚集留存是肝功能损伤的重要诱因[4]。血必净是目前用于治疗脓毒症的中药静脉注射液，研究显示其能够在改善脓毒症患者病情的同时，提升血小板计数[5-6]，但其对脓毒症相关性血小板减少症（thrombocytopenia，TCP）肝脏的保护作用尚未见报道。本文旨在研究血必净对脓毒症血小板减少大鼠急性肝损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备
雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠40只，6周龄，体质量为（200±10）g，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物中心，常规适应性喂养7 d。术前禁食12 h、自由饮水并称重。将25 g水合氯醛溶于500 mL生理盐水制备5%水合氯醛溶液，6 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后固定，备皮铺巾。沿腹正中线作一长约2 cm切口，暴露盲肠并于远端盲肠1/2处结扎，在结扎部位远端盲肠中部，用16号穿刺针穿刺2次形成肠瘘[假手术组（Sham）仅分离结缔组织和推移盲肠内容物，不结扎、穿刺]，将盲肠复位，缝合腹壁切口，皮下注射50 mL/kg生理盐水复苏，观察喂养。
1.2 分组给药
将40只大鼠随机分为4组：Sham组、盲肠结扎穿孔模型（CLP）组、血必净治疗（XBJ）组和血必净提前干预（pre-XBJ）组，每组各10只。pre-XBJ组在术前3 d开始按10 mL/kg予尾静脉注射血必净（天津红日药业公司），每12 h注射1次，sham组、CLP组、XBJ组给予等体积生理盐水；术后0 h、12 h，给予XBJ组尾静脉注射量血必净，注射量为10 mL/kg，其余各组给予等体积生理盐水。
1.3 血小板计数及肝功能检测
造模成功后24 h，摘大鼠眼球取血30 μL至抗凝离心管中，并于4 h内在动物血细胞计数仪上检测血小板计数（platelet count，PLT），大鼠血小板计数正常值为（620~1360）×109/L，低于620×109/L为血小板减少；采用海邦奕生物科技有限公司的试剂盒，根据说明书检测各组大鼠血样中肝功能指标谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TB）水平。
1.4 炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6和IL-18表达量的检测
取各组大鼠眼球血，分离血清，用ELISA试剂盒检测血中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-18水平，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。
1.5 HE染色
造模成功后24 h，取各组大鼠肝脏组织，4%甲醛固定48 h以上，洗涤脱水透明处理后，石蜡包埋切片，用苏木精-伊红染色，显微镜下观察并拍片。
1.6 免疫组织化学检测肝脏组织内血小板聚集黏附情况
将大鼠肝脏组织经固定脱水，石蜡包埋、切片后。脱蜡后高温抗原修复，洗片，阻断内源性过氧化物酶，再次洗片并封闭，CD41抗体4℃孵育过夜，洗片，HRP标记的二抗孵育，洗片，DAB显色，再使用苏木精复染细胞核，脱水，封片，显微镜下观察并分析结果。
1.7 统计学方法
应用SPSS 22.0软件进行统计学处理，正态分布或近似正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血必净对脓毒症TCP大鼠血小板计数的影响
盲肠结扎穿孔术后24 h，CLP组大鼠血小板计数显著低于sham组（P＜0.01），而pre-XBJ组大鼠的血小板计数较CLP组高（P＜0.05），pre-XBJ组与XBJ组差异无统计学意义（P>0.05），见图1。
注：a与Sham组比较，P<0.05; b与CLP组比较，P<0.05
图1血必净对TCP大鼠血小板计数的影响
2.2 血必净对脓毒症TCP大鼠肝功能指标的影响
与sham组相比，CLP组的AST、ALT、TB水平显著升高（P＜0.01）；与CLP组相比，pre-XBJ组和XBJ组的AST、ALT、TB水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。
2.3 血必净对脓毒症TCP大鼠炎症因子的影响
CLP造模术后24 h，CLP组炎症因子TNF-α、IL-6和IL-18均升高（P＜0.05），与CLP组相比，pre-XBJ组和XBJ组的TNF-α、IL-6和IL-18水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。
注：a与Sham组比较，P<0.05; b与CLP组比较，P<0.05
图2血必净对TCP大鼠AST、ALT和TB的影响
注：a与Sham组比较，P<0.05; b与CLP组比较，P<0.05
图3血必净对TCP大鼠TNF-α、IL-6和IL-18的影响
2.4 血必净对脓毒症TCP大鼠肝脏损伤的影响
与sham组相比，CLP组大鼠的肝脏组织缺血明显、水肿，小静脉狭窄，炎性细胞浸润增多；pre-XBJ组和XBJ组大鼠肝脏组织的缺血、水肿情况减轻，炎性细胞浸润减少，见图4。
图4各组大鼠肝脏组织病理分析（HE染色，×400）
2.5 血必净对脓毒症TCP大鼠肝脏血小板聚集黏附的影响
与sham组相比，CLP组大鼠肝脏组织内血管表面血小板黏附明显增多；与CLP组相比，XBJ组和pre-XBJ组大鼠肝脏组织内血管表面血小板黏附聚集减少，见图5。
图5各组大鼠肝脏组织中血小板聚集黏附情况（免疫组织化学，×400）
3 讨论
脓毒症是由感染引发的机体免疫紊乱综合征，是目前ICU患者死亡的主要原因之一[7-8]。脓毒症严重时常可导致多脏器功能损伤，其中全身微血管堵塞、微血栓的激活以及纤维蛋白溶解和出血增多即弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）是多脏器功能损伤的主要诱因[8-9]。而血小板的D过度激活、聚集黏附能力增强在DIC的形成中扮演着重要的作用[9-10]。血小板减少症是脓毒症患者常见的并发症，脓毒症血小板减少症患者体内血小板通常呈异常活化状态，血小板聚集黏附能力的增强使其更容易滞留于脏期内引发脏器功能损伤，因而该类患者更易发生多脏器衰竭[10-12]。急性肝损伤是脓毒症患者最早见的靶器官损伤[13]。
血必净是目前用于治疗脓毒症的最常见中药注射液，能够在一定程度上防治脓毒症患者的炎症反应[14-16]。近年来有研究报道显示，血必净不但能够改善脓毒症患者的病情，并且能够提升脓毒症血小板减少症患者的血小板计数[17-18]。但血必净对脓毒症血小板减少症患者急性肝损伤是否具有预防改善作用，尚未见报道。为探究血必净是否对脓毒症血小板减少时肝损伤具有保护作用，本研究采用盲肠结扎穿孔术制备了大鼠脓毒症血小板减少模型并添加血必净预干预和术后干预，观察并检测各组大鼠血小板计数、肝功能指标、炎症因子的表达情况，并取肝脏组织对其进行病理分析和免疫组织化学分析观察肝损伤情况和血小板聚集黏附情况。
实验结果显示：在远端盲肠1/2处结扎并穿孔术后24 h大鼠血小板计数明显低于Sham组并且血小板计数约下降为Sham组的50%，结合模型组炎症因子显著高于假手术及生存率等结果，提示盲肠结扎穿孔制备脓毒症血小板减少大鼠模型制备成功。血必净干预实验结果显示血必净预干预和术后干预均能够在一定程度上提升血小板计数，CLP组的肝功能指标AST、ALT和TB显著增高，而血必净干预后明显下调，结合HE染色病理分析结果提示血必净能够在一定程度上预防和改善脓毒症TCP时大鼠肝损伤。炎症因子检测结果也提示血必净能够减轻脓毒症血小板减少大鼠的炎症反应。除此之外，免疫组织化学实验结果显示CLP组大鼠肝脏组织中血小板聚集黏附较Sham明显增多，而血必净预干预和术后干预组肝脏组织中血小板聚集黏附均明显减少，提示血必净对血小板在肝脏组织内的聚集黏附具有一定的改善作用。
综上所述，血必净具有改善脓毒症炎症反应的作用，同时也能够提升脓毒症血小板减少血小板计数，并且改善血小板在肝脏中的聚集黏附，对脓毒症血小板减少时的肝脏损伤具有一定的保护作用。但血必净对脓毒症血小板减少肝脏保护作用的具体分子机制尚需进一步研究。