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结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率为10.0%，居全球第3位；死亡率为9.4%，居全球第2位，且其发病率呈逐年上升趋势[1-2]，严重威胁人类生命健康。放疗、化疗及靶向药物治疗已成为中晚期CRC及复发病例的常规辅助治疗，并取得了一定的效果，但由于放疗、化疗及靶向药物的毒性和耐受[3-4]，严重影响患者的治疗效果及预后。因此探讨药物抑制肿瘤增殖转移的机制成为目前研究的热点。自噬是一种重要的细胞生理反应，如同细胞凋亡，通常在细胞中处于较低的基础水平，但在细胞应激状态下如营养缺乏时，可以被强烈诱导[5]，它通过溶酶体降解自身成分参与细胞的生存、分化和稳态[6]。自噬水平的降低导致蛋白质和细胞器功能失调并使其积聚，这可能导致恶性肿瘤的形成；而水平的增加可以抑制细胞的增殖[7]。肌微管素相关蛋白3（myotubularin-related protein 3，MTMR3）是一种广泛存在于人类机体内的蛋白，其与多种肿瘤的发生发展具有密切关系[8-9]。有研究提示MTMR3可通过抑制乳腺癌细胞自噬促进肿瘤细胞的增殖[10]。他汀类药物是临床上常见的一类降血脂药物，有明显降低心血管疾病死亡率和发病率的作用。有研究显示其可通过促进细胞周期停滞、抑制肿瘤血管生成和分化而抑制肿瘤生长[11-12]，其中阿托伐他汀钙（atorvastatin caleium，ATO）可通过促进自噬抑制乳腺癌的增殖[13]，也可抑制CRC细胞的增殖[14]，但是否通过诱导结直肠癌细胞自噬而起作用尚鲜见报道。本课题组前期研究证实ATO可抑制CRC的增殖迁移，本研究拟进一步探讨ATO抑制CRC细胞增殖迁移的机制，为临床治疗CRC提供新的方法和理论依据。
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1 材料和方法
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1.1 细胞培养和试剂
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结直肠癌HCT116细胞购自长沙丰晖生物公司，HCT116细胞使用含10%胎牛血清的完全培养基于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，胎牛血清购自于浙江天杭生物科技股份公司。ATO、MTT粉末及DMSO购于北京索莱宝公司。自噬抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）购自上海MCE公司。一抗MTMR3购自美国Proteintech公司。一抗β-actin、LC3、P62以及羊抗鼠和羊抗兔均购自武汉博士德生物有限股份公司。
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1.2 HE及免疫组化染色
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选取3例来自南华医院CRC患者的癌组织及癌旁组织的蜡块，制作为石蜡切片，然后依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5 min，然后将其放入无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各3 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，60%乙醇5 min，然后用单蒸水浸洗3次。HE染色用苏木素染色5 min，自来水冲洗后置于1%盐酸乙醇中20 s，0.5%的伊红液染色2 min，然后用单蒸水洗20 s，之后将其放于60%、80%、95%、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中各浸泡5 min脱水，于二甲苯Ⅲ和二甲苯Ⅳ中各浸泡5 min。免疫组化染色用Tris-EDTA修复切片，滴加内源性过氧化物酶阻断剂浸泡组织10 min，加入一抗于4℃过夜，加反应增强液20 min后，加入二抗于37℃进行孵育，随后按照说明书进行显色，并加入苏木素进行返蓝，盐酸酒精分化，最后于60%、80%、95%、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中各浸泡5 min脱水，最后进行透明。两组染色玻片最后均使用中性树胶封片，显微镜下进行拍摄。
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1.3 细胞活力的检测
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搜集处于对数生长期的HCT116细胞悬液进行细胞计数，按每孔1×104个细胞种于96孔板中，将96孔板放于5%CO2、37℃培养箱中24 h待细胞贴壁，加入0、12.5、25、50、100 μmol/L浓度ATO处理24 h后每孔加10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，继续于培养箱中避光孵育4 h后加入DMSO，待紫色结晶充分溶解后于酶标仪于490 nm处测量每孔的吸光度（OD）值。
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1.4 细胞集落形成实验
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将处理好的HCT116细胞种于6孔板中，使用完全培养基培养14 d，中途每3 d更换1次培养基，待集落形成后使用PBS洗涤细胞2次，随后使用甲醇固定，并用结晶紫染色，最后进行拍照。
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1.5 细胞划痕实验
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用PBS清洗6孔板，每个孔加入2 m L含有HCT116细胞的培养基，将HCT116细胞平均分别铺在6孔板里，第2天待其铺满后，使用10 μL Tip头进行划线，PBS洗涤细胞后加入含2%胎牛血清的培养液及相应药物，然后在不同时间段进行拍照。
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1.6 RT-qPCR
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首先由苏州吉玛公司合成3条si-MTMR3序列，用GP-transfect-Mate转染48 h后，进行RNA的提取，然后按照逆转录试剂盒操作要求获得cDNA，最后按abm公司提供的说明书进行RT-PCR，采用2-△△Ct法进行定量分析，选择敲低效率最高的序列进行后续实验。
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1.7 蛋白免疫印迹法（Western blot）
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将处理好的HCT116细胞进行贴壁细胞全蛋白的提取。用10%的分离胶进行电泳，恒压60 V、30 min电泳浓缩胶，恒压120 V、1 h电泳分离胶，之后使用恒流200 mA、2 h湿转将分子转移至聚偏二氟乙烯（武汉博士德公司）上，随后封闭2 h，一抗封闭过夜，PBST洗涤5次，于室温孵育二抗2 h，用PBST洗涤3次，然后进行显影。
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1.8 统计学分析
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所有实验均重复3次，数据为3次独立实验的均值±标准差。统计分析使用GraphPad Prism8.0.1进行，多组比较用单因素ANOVA分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 MTMR3、P62在结直肠癌组织中高表达
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HE染色发现，癌组织形态结构较癌旁组织发生明显改变（图1 A、B）。使用免疫组化检测MTMR3、P62在CRC中的表达情况，发现3例患者癌组织中的棕褐色颗粒明显高于癌旁组织，MTMR3、P62在癌组织中的表达明显高于癌旁组织，（图1 C-F）。
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图1 MTMR3、P62在结直肠癌组织中高表达
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2.2 ATO可抑制HCT116细胞的活力、增殖及迁移
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DMSO组（0 μmol/L ATO）与CON组相比细胞存活率无明显差异，各药物浓度组与DMSO组相比，ATO浓度越高，抑制HCT116细胞效果越明显（图2 A）。为进一步探讨ATO对CRC的抑瘤作用，使用12.5、25、37.5 μmol/L ATO处理HCT116细胞后进行克隆集落形成实验及细胞划痕实验，结果显示DMSO组与对照组相比，无论是细胞克隆形成能力还是细胞迁移能力均无明显差异，各浓度ATO组与DMSO组对比发现，ATO以浓度依赖性方式抑制HCT116细胞的克隆集落形成能力和迁移能力（图2 B、2C）。
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图2 ATO对HCT116细胞的抑瘤作用
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2.3 ATO可诱导HCT116细胞自噬
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为了明确ATO对HCT116细胞的内源性LC3蛋白与P62蛋白的影响，使用12.5、25、37.5 μmol/L ATO处理HCT116细胞检测P62及LC3蛋白的表达情况，结果显示，DMSO组与CON组差异无统计学意义，各浓度ATO组与DMSO组相比，ATO处理HCT116细胞后，从25 μmol/L起，随着ATO浓度的增加，自噬相关蛋白LC3II/I比值的表达水平逐渐升高，P62蛋白的表达水平逐渐下降（图4）。因25 μmol/L的ATO对细胞存活率的抑制尚小于50%，因此后续实验均采用25 μmol/L的ATO进行。
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图3 ATO可诱导自噬
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2.4 ATO可下调HCT116细胞的MTMR3蛋白的表达
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DMSO组与CON组MTMR3蛋白的表达差异无统计学意义，各浓度ATO组与DMSO组相比，MTMR3蛋白随ATO浓度的增高而下调（图4）。
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图4 ATO可下调 HCT116细胞的MTMR3蛋白的表达
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2.5 自噬抑制剂CQ可逆转ATO的抑HCT116细胞生长作用
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为明确在ATO治疗下自噬对HCT116细胞的影响，将HCT116细胞分成CON组、ATO组、CQ组和ATO+CQ组，查阅文献后选择CQ浓度为10 μmol/L[15]，后续实验均采用该浓度。MTT结果显示，ATO组可以降低细胞存活率，而加入自噬抑制剂CQ后，细胞存活率比单独使用ATO高（图5 A）。接下来采用同样的分组，进行细胞克隆形成实验及细胞划痕实验，结果表明，ATO+CQ组较ATO组细胞克隆形成率及细胞迁移率均高（图5 B、C）。
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图5 CQ逆转ATO的抑癌作用
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2.6 自噬抑制剂CQ逆转ATO对HCT116细胞自噬的诱导
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ATO组自噬蛋白 LC3 II／Ｉ的比值高于对照组，ATO+CQ 组 LC3 II / I 的比值进一步升高，ATO 组 P62 蛋白表达下降，而加入 CQ 后 P62 的下降被抑制（图6）。
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图6 自噬抑制剂 CQ 逆转 ATO 对 HCT 116 细胞自噬的诱导
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2.7 自噬抑制剂CQ对MTMR3蛋白的表达无影响
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Western Blot检测结果发现，与CON组相比，CQ组MTMR3蛋白的表达无明显差异，ATO+CQ组与ATO组相比，MTMR3蛋白的表达无统计学意义（图7）。
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图7 自噬抑制剂 CQ 对MTMR3蛋白表达的影响
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2.8 si-MTMR3促进ATO的抑癌生长作用
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本研究通过siRNA在HCT116细胞中干扰MTMR3的表达，并使用q-PCR技术验证其敲低效率，q-PCR结果显示NC组与CON组相比无敲低效果，si-MTR3-406为敲低效率最高的一条序列（图8A），因此选择该序列用来做后续实验。为评定si-MTMR3与ATO对CRC细胞的影响，本研究采用MTT法测定HCT116的细胞活力。转染si-MTMR3 24h对细胞活力无显著影响，但48 h后，敲低MTMR3或使用ATO均显著降低了细胞活力，二者联合使用则产生了协同抑制效果（图8B）。进一步的克隆集落和划痕实验结果显示，si-MTMR3和ATO各自能减弱HCT116细胞的克隆能力和迁移能力，且联合作用更为明显，表明si-MTMR3能增强ATO对CRC细胞增殖和迁移能力的抑制作用（图8C、8D）。
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2.9 si-MTMR3促进ATO诱导自噬
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设置CON组、ATO组、si-MTMR3组及si-MTME3+ATO组，经si-MTMR3转染并培养48 h后，WB检测发现ATO或si-MTMR3均可增加LC3加TM比值、降低P62蛋白表达；si-MTME3+ATO组中这些变化更明显（图9）。
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3 讨论
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他汀类药物是一种HMG-CoA还原酶抑制药，是心血管系统疾病的一类常用的调节血脂的药物，最新研究发现，他汀类药物不仅具有调脂能力还具对多种疾病具有治疗潜力，如哮喘、肾细胞癌及胃肠道肿瘤等疾病[16-20]。他汀类药物的使用可能降低患CRC的风险[21]。使用他汀类药物的CRC患者较不使用的术后死亡率明显降低[22]。本研究提示ATO处理后的HCT116细胞活力、增殖迁移的能力均下降，ATO浓度越高，抑制HCT116细胞效果越明显，呈浓度依赖性抑制，说明ATO对HCT116细胞有明显抑制作用。
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研究表明ATO可诱导肿瘤细胞自噬[23]。本研究结果也证实ATO通过诱导HCT116自噬进而抑制肿瘤细胞的增殖与迁移。自噬是一种复杂的调控机制，与衰老、炎症性疾病及恶性肿瘤等疾病均具有紧密关系[24-26]，并且自噬作为一种细胞自我降解的过程，在控制肿瘤的发生发展与治疗中都有重要作用。据报道，CRC自噬水平升高有助于抑制肿瘤的生长[27]。研究发现，P62蛋白的下降可能是自噬抑制肿瘤生长的重要机制[28]，若自噬受损将导致P62积累，P62可通过激活转录因子NF-κB和Nrf2以促进细胞存活、血管生成及炎症的形成。同时自噬发生时，LC3会酶解部分多肽形成LC3Ⅰ，而LC3Ⅰ被泛素样体系修饰加工后会与磷脂酰乙醇胺（PE）结合转变为LC3Ⅱ[29]，因此LC3Ⅱ/Ⅰ的比值可用来评估自噬水平的高低。通常情况下，自噬相关蛋白P62在癌组织中高表达，本实验证实P62在CRC组织中高表达，这与Nakayama等[30]的实验结果一致，其主要作为连接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性的包裹进自噬体，然后自噬溶酶体中的蛋白水解酶将P62降解[31]，因此P62蛋白的表达含量与自噬发生的多少呈负相关。本研究结果进一步揭示了ATO通过促进自噬相关途径抑制肿瘤细胞增殖和迁移的潜在机制。本实验发现ATO处理能显著上调LC3显著上比值，下调P62蛋白的表达，同时使用自噬抑制剂CQ能逆转这些效应，进一步验证了ATO诱导自噬在其抗肿瘤作用中的重要性。
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图8 si-MTMR3促进ATO对肿瘤生长的抑制作用
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图9 si-MTMR3促进ATO诱导自噬
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MTMR3作为一种参与自噬起始的负调控自噬相关基因[32]，参与很多类肿瘤的发生发展过程，本实验证实CRC组织中MTMR3的表达高于癌旁组织，并发现ATO可使HCT116细胞的MTMR3的表达下调，导致P62蛋白表达下降且伴有LC3Ⅱ/Ⅰ的表达上升。而si-MTMR3同样能够抑制HCT116细胞活力、集落形成能力及迁移能力，伴有LC3Ⅱ/Ⅰ的表达上升，与ATO作用于HCT116细胞下调MTMR3结果一致，且二者联用有协同效果，均能诱导细胞自噬的发生。研究反面证实自噬抑制剂CQ可逆转ATO的抑HCT116细胞生长作用，但对MTMR3蛋白的表达无影响。这些实验说明ATO可通过下调MTMR3诱导细胞自噬发挥抗增殖迁移的作用。
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本研究具有一些局限性，研究中只采取了HCT116细胞一种细胞系，也未进行动物实验验证。其次自噬的角色在癌症发展的不同阶段是复杂且双面性的，既可以促进也可以抑制肿瘤的生长[37]，在早期肿瘤中，自噬可通过清除受损的细胞器及折叠错误的蛋白质从而抑制肿瘤的进展，然而在肿瘤的晚期，自噬对物质的动态降解又可为癌细胞带来能量，从而促进其存活和生长，并能导致癌细胞对治疗药物产生耐药，因此，ATO对HCT116细胞的治疗在后期是否会产生耐药仍值得进一步研究。
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摘要
目的：探讨阿托伐他汀钙（ATO）诱导自噬抑制结直肠癌（CRC）HCT116细胞增殖与迁移的机制。方法：采用免疫组化检测结直肠癌组织及癌旁组织中肌微管素相关蛋白3（MTMR3）及P62的表达，用0、12.5、25、50、100 μmol/L浓度ATO处理结直肠癌HCT116细胞系24 h，采用MTT法检测HCT116细胞活力，使用12.5、25、37.5 μmol/L ATO处理HCT116细胞后，进行克隆集落形成实验及细胞划痕实验，并用Western blot法检测其MTMR3及自噬相关蛋白LC3和P62蛋白的表达。ATO联合si-MTMR3、ATO联合自噬抑制剂氯喹及单独氯喹处理结肠癌细胞HCT116，检测HCT116细胞活力、集落形成及迁移能力，并使用Western blot法检测MTMR3、LC3和P62蛋白表达。结果：MTMR3和P62在CRC组织中高表达，经ATO处理的HCT116细胞，药物浓度越高，细胞活力、集落形成和迁移能力越低，其MTMR3及P62蛋白表达亦明显下降，自噬相关蛋白LC3II/I比值的表达水平逐渐升高，自噬抑制剂氯喹可逆转AT O对HCT细胞的抑制作用，si-MTMR3与ATO对HCT116细胞有协同抑制作用，并且si-MTMR3可诱导自噬的发生。结论：ATO能抑制结肠癌HCT116细胞的增殖及迁移，其机制可能与通过抑制MTMR3的表达、诱导细胞自噬有关。
Abstract
Objective To investigate the mechanisms underlying the induction of autophagy inhibition and the subsequent suppression of proliferation and migration in colorectal cancer (CRC) HCT116 cells by atorvastatin calcium (ATO). Methods Firstly, immunohistochemical staining was performed to detect the expression of MTMR3 and P62 in CRC tissues and adjacent non-cancerous tissues. Secondly, HCT116 cells were treated with ATO at concentrations of 0, 12.5, 25, 50, and 100 μmol/L for 24 hours, and cell viability was assessed using the MTT assay. Thirdly, HCT116 cells were treated with ATO at concentrations of 12.5, 25, and 37.5 μmol/L, and colony formation and cell migration assays were conducted. Western blot analysis was performed to examine the expression of MTMR3, as well as autophagy-related proteins LC3 and P62. Lastly, HCT116 cells were treated with ATO in combination with si-MTMR3 or autophagy inhibitor chloroquine, or with chloroquine alone. Cell viability, colony formation, and migration capacity of HCT116 cells were assessed, and the expression of MTMR3, LC3, and P62 proteins was examined using Western blot analysis. Results The results showed that MTMR3 and P62 were highly expressed in CRC tissues. Treatment of HCT116 cells with ATO resulted in decreased cell viability, colony formation, and migration capacity, which correlated with reduced expression of MTMR3 and P62, as well as an increase in the LC3II/I ratio, indicative of autophagy induction. Moreover, the inhibitory effects of ATO on HCT116 cells were reversed by the autophagy inhibitor chloroquine. Additionally, si-MTMR3 exhibited a synergistic inhibitory effect with ATO on HCT116 cells and induced autophagy. Conclusion ATO suppresses proliferation and migration of HCT116 cells in CRC, potentially through the downregulation of MTMR3 expression and induction of cellular autophagy.
