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黄芪甲苷对脂多糖调节巨噬细胞M1/M2型极化的影响及机制研究

  • 鲁富泰

    机 构：

    天津市人民医院麻醉科（ 300121 ）

    ×
  • ，杨涛

    机 构：

    天津市人民医院麻醉科（ 300121 ）

    ×
  • ，李曼

    机 构：

    天津市人民医院麻醉科（ 300121 ）

    ×
  • ，王蕾

    机 构：

    天津市人民医院麻醉科（ 300121 ）

    ×
  • ，耿立成

    机 构：

    天津市人民医院麻醉科（ 300121 ）

    ×

天津市人民医院麻醉科（ 300121 ）；

Effect of Astragaloside Ⅳ on lipopolysaccharide-induced macrophages M1/M2 polarization and related mechanism

  • Lu Fu-tai

    Affiliation：

    Department of Anesthesiology, Tianjin Union Medical Center, Tianjin( 300121 ), China

    ×
  • ，Yang Tao

    Affiliation：

    Department of Anesthesiology, Tianjin Union Medical Center, Tianjin( 300121 ), China

    ×
  • ，Li Man

    Affiliation：

    Department of Anesthesiology, Tianjin Union Medical Center, Tianjin( 300121 ), China

    ×
  • ，Wang Lei

    Affiliation：

    Department of Anesthesiology, Tianjin Union Medical Center, Tianjin( 300121 ), China

    ×
  • ，Geng Li-cheng

    Affiliation：

    Department of Anesthesiology, Tianjin Union Medical Center, Tianjin( 300121 ), China

    ×

Department of Anesthesiology, Tianjin Union Medical Center, Tianjin( 300121 ), China；

通讯作者:

耿立成,E-mail: genglicheng2013@126.com

中图分类号:R282；R631

文献标识码:A

DOI:10.3969/j.issn.1007-6948.2024.06.026

参考文献 1
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参考文献 17
Fu JN,Wu H.Structural mechanisms of NLRP3 inflammasome assembly and activation[J].Annu Rev Immunol,2023,41:301-316.
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目录contents

    摘要

    目的：评价黄芪甲苷（AS-Ⅳ）对脂多糖（LPS）调节巨噬细胞M1/M2型极化的影响及其相关机制。方法：体外培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7，采用随机数字表法分为3组：对照组（C组）、LPS组、AS-Ⅳ干预（AS-Ⅳ）组。C组细胞正常培养；LPS组加入终浓度为100 ng/mL的LPS处理24 h；AS-Ⅳ组加入终浓度为100 ng/mL的LPS和200 μg/mL的AS-Ⅳ处理24 h。利用ELISA法检测白细胞介素（IL）-1β、IL-10和IL-18水平，qRT-PCR法检测CD86、CD11c、CD206和精氨酸酶-1（Arg-1）的mRNA表达，流式细胞术检测CD86（+）和CD206（+）的细胞百分比，Western blot法检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的蛋白表达。结果：与C组比较，LPS组IL-1β和IL-18水平、CD86和CD11c mRNA表达、CD86（+）细胞百分比、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达升高，IL-10水平、CD206和Arg-1 mRNA表达、CD206（+）细胞百分比降低（P＜0.05）；与LPS组比较，AS-Ⅳ组IL-1β和IL-18水平、CD86和CD11c mRNA表达、CD86（+）细胞百分比、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达降低，IL-10水平、CD206和Arg-1 mRNA表达、CD206（+）细胞百分比升高（P＜0.05）。结论：AS-Ⅳ能够抑制LPS诱导的巨噬细胞M1型极化并促进其向M2型极化，其机制与下调NLRP3炎症小体表达有关。

    Abstract

    Objective To evaluate the effect of Astragaloside Ⅳ (AS-Ⅳ) on lipopolysaccharide (LPS)-induced macrophages M1/M2 polarization and related mechanism. Methods Mouse monocyte-derived macrophages RAW264.7 were cultured in vitro and were randomly divided into 3 groups: control group (group C), LPS group (group LPS) and AS-Ⅳ treatment group (group AS-Ⅳ). In group C, cells were cultured in the common culture medium. In group LPS, 100 ng/mL LPS was added into the culture medium for 24 h incubation. In group AS-Ⅳ, 100 ng/mL LPS and 200 μg/mL AS-Ⅳ were added into the culture medium for 24 h incubation. The levels of IL-1β, IL-10 and IL-18 in culture medium were measured by ELISA assay. The mRNA levels of CD86, CD11c, CD206 and Arginase-1(Arg-1) were measured by qRT-PCR assay. The percentage of CD86(+) and CD206(+) cells was assessed by flow cytometry. The expression levels of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor containing pyrin domain 3 (NLRP3) and apoptosis-associated speck-like protein (ASC) were detected by Western blot assay. Results Compared with group C, the levels of IL-1β and IL-18, the mRNA levels of CD86 and CD11c, the percentage of CD86(+) cells and the expression levels of NLRP3, ASC and caspase-1 were increased, while the level of IL-10 and the mRNA levels of CD206 and Arg-1, and the percentage of CD206(+) cells were decreased in group LPS(P<0.05). Compared with group LPS, the levels of IL-1β and IL-18, the mRNA levels of CD86 and CD11c, the percentage of CD86(+) cells and the expression levels of NLRP3, ASC and caspase-1 were decreased, while the level of IL-10 and the mRNA levels of CD206 and Arg-1, and the percentage of CD206(+) cells were increased in group AS-Ⅳ(P<0.05). Conclusion AS-Ⅳ can inhibit LPS-induced macrophages M1 polarizaion and promote macrophages M2 polarizaion, whose mechanism may be associated with down-regulating NLRP3 inflammasome expression.

    关键词

    黄芪甲苷 ； 脂多糖 ； 巨噬细胞 ； 炎症 ； 脓毒症

  • 脓毒症是一种因宿主的感染免疫失衡而危及生命的器官功能障碍综合征[1]。巨噬细胞的M1型和M2型极化分别代表细胞的促炎表型和抗炎表型，M1型极化的巨噬细胞能够介导机体的剧烈炎症反应，是脓毒症导致多脏器损伤的关键机制[2-3]。本课题组前期发现，黄芪甲苷（astragaloside，AS-Ⅳ）对脓毒症具有明确的保护作用，然而AS-Ⅳ对脓毒症时巨噬细胞表型极化的影响及具体机制尚未明确[4]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（nod-like receptor，pyrin domain containing3，NLRP3）炎症小体是介导脓毒症炎症反应的关键信号[5]，并且在多种免疫炎性疾病中介导巨噬细胞发生M1型极化，以促进炎症反应发生[6-8]。本研究拟评价AS-Ⅳ对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）调节巨噬细胞M1/M2型极化的影响以及相关的分子机制，为AS-Ⅳ治疗脓毒症提供理论依据。

  • 1 材料与方法

  • 1.1 材料

  • 1.1.1 细胞与培养

  • 小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）使用DMEM完全培养基培养。待细胞生长融合至80%时，使用0.25%胰酶和2%EDTA消化传代，并接种于6孔细胞培养板（1×106个/孔，2 mL/孔）或96孔细胞培养板（5×104个/孔，100 mL/孔）中，于37℃、含有5%CO2的细胞培养箱中培养备用。

  • 1.1.2 药物与试剂

  • 细胞培养所需试剂全部购自上海碧云天生物技术有限公司；AS-Ⅳ购自上海源叶生物科技有限公司；LPS购自美国Sigma公司；白细胞介素（IL）-1β、IL-10和IL-18的ELISA试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司；CD86和CD206流式抗体购自美国BD公司；兔抗NLRP3单克隆抗体、兔抗凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）多克隆抗体、兔抗半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）多克隆抗体、小鼠抗GAPDH单克隆抗体均购自武汉Proteintech公司。

  • 1.1.3 仪器与设备

  • 正置光学显微镜（德国Carl Zeiss公司）；高速低温离心机（美国Thermo Fisher公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）；SDS-PAGE凝胶电泳系统及全自动凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

  • 1.2 方法

  • 1.2.1 分组与处理

  • 利用随机数字表法将RAW264.7细胞随机分为3组：对照组（C组）、LPS组、AS-Ⅳ干预组（AS-Ⅳ组）。C组细胞正常培养；LPS组加入终浓度为100 ng/mL的LPS处理24 h；AS-Ⅳ组加入终浓度为100 ng/mL的LPS和200 μg/mL的AS-Ⅳ处理24 h。各组处理24 h结束后，进行下列指标测定。

  • 1.2.2 ELISA法检测细胞因子水平

  • 每组取6孔板中5孔重复的细胞上清液，利用ELISA法分别检测细胞上清液中IL-1β、IL-10和IL-18的表达水平。参考ELISA试剂盒中的说明书进行操作，利用酶标仪对450 nm波长处的光密度（OD）值进行检测，并计算IL-1β、IL-10和IL-18的浓度水平。

  • 1.2.3 荧光定量PCR检测细胞极化表型标志物mRNA表达

  • 每组取6孔板中5孔重复的细胞，使用Trizol（美国Invitrogen公司）提取细胞样本中总RNA，利用cDNA反转录试剂盒（日本TaKaRa公司）反转录合成cDNA。以1 μg总RNA为模板，总反应体系为20 μL。反应条件：25℃预热10 min，55℃反转录30 min，85℃ 5 min使反转录酶失活。所合成cDNA于-20℃条件保存。CD86引物上游序列：5’-ACGTATTGGAAGGAGATTACAGCT-3’，下游序列：5’-TCTGTCAGCGTTACTATCCCGC-3’。CD11c引物上游序列：5’-TGCCAGGATGACCTTAGTGTCG-3’，下游序列：5’-CAGAGTGACTGTGGTTCCGTAG-3’。CD206引物上游序列：5’-GTTCACCTGGAGTGATGGTTCTC-3’，下游序列：5’-AGGACATGCCAGGGTCACCTTT-3’。精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）引物上游序列：5’-CCATCCTATCACCGCAAAACCTG-3’，下游序列：5’-GGGTAACAGTTGTCAGACACCAC-3’。GAPDH引物上游序列：5’-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3’，下游序列：5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’。使用荧光定量试剂盒（日本TaKaRa公司）进行PCR扩增，反应体系25 μL。反应条件：95℃条件下进行预变性30 s，95℃条件下进行变性5 s，60℃条件下退火延伸34 s，共40个循环。应用荧光定量PCR仪（美国Thermo公司），采用2-△△CT法对数据进行相对定量分析。

  • 1.2.4 细胞极化表型标志物（+）细胞百分比的测定

  • 每组取6孔板中3孔重复的细胞，重新悬浮于100 μL的PBS溶液中，依次加CD86和CD206的流式抗体各10 μL，室温避光孵育20 min后使用4%多聚甲醛固定。利用流式细胞仪（美国BD公司）检测各组CD86（+）细胞和CD206（+）细胞的百分比水平（%）。

  • 1.2.5 NLRP3炎症小体蛋白表达的测定

  • 每组取6孔板中3孔重复的细胞，充分裂解，4℃条件下离心10 min（1×104 r/min，离心半径10 cm），收集上清，BCA法测定蛋白浓度。于10%SDS-PAGE凝胶泳道中上样电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入以下一抗：兔抗NLRP3单克隆抗体（稀释度1∶1000）、兔抗ASC多克隆抗体（稀释度1∶1000）、兔抗caspase-1多克隆抗体（稀释度1∶1000）和小鼠抗GAPDH单克隆抗体（稀释度1∶3000），4℃条件下孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（稀释度1∶5000）室温孵育2 h。洗膜后在暗室中以增强化学发光液进行显色检测阳性信号，采用图像分析系统进行扫描曝光及条带分析，以目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

  • 1.3 统计学分析

  • 采用GraphPad Prism 10软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

  • 2 结果

  • 2.1 AS-Ⅳ对巨噬细胞释放细胞因子水平的影响

  • 与C组比较，LPS组IL-1β和IL-18水平显著升高，IL-10水平显著降低（P＜0.05）；与LPS组比较，AS-Ⅳ组IL-1β和IL-18水平显著降低，IL-10水平显著升高（P＜0.05），见表1。

  • 表1 三组巨噬细胞的细胞因子水平比较

  • 注：a与C组比较，P＜0.05；b与LPS组比较，P＜0.05

  • 2.2 AS-Ⅳ对巨噬细胞极化表型标志物mRNA表达的影响

  • 与C组比较，LPS组CD86和CD11c的mRNA表达显著升高，CD206和Arg-1的mRNA表达显著降低（P＜0.05）；与LPS组比较，AS-Ⅳ组CD86和CD11c的mRNA表达显著降低，CD206和Arg-1的mRNA表达显著升高（P＜0.05），见表2。

  • 表2 三组细胞的巨噬细胞极化表型标志物mRNA表达水平比较

  • 注：a与C组比较，P＜0.05；b与LPS组比较，P＜0.05

  • 2.3 AS-Ⅳ对巨噬细胞极化表型标志物阳性细胞百分比的影响

  • 与C组比较，LPS组CD86（+）细胞的百分比显著升高，CD206（+）细胞的百分比显著降低（P＜0.05）；与LPS组比较，CD86（+）细胞的百分比显著降低，CD86（+）细胞的百分比显著升高（P＜0.05），见表3、图1。

  • 表3 三组细胞的巨噬细胞极化表型标志物细胞百分比水平的比较

  • 注：a与C组比较，P＜0.05；b与LPS组比较，P＜0.05

  • 图1 流式细胞术测定RAW264.7细胞中CD86（+）细胞和CD206（+）细胞百分比的情况

  • 2.4 AS-Ⅳ对NLRP3炎症小体蛋白表达的影响

  • 与C组比较，LPS组NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与LPS组比较，AS-Ⅳ组NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达显著降低（P＜0.05），见表4、图2。

  • 表4 三组细胞的NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平比较

  • 注：a与C组比较，P＜0.05；b与LPS组比较，P＜0.05

  • 图2 Western blot法测定RAW264.7细胞中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达情况

  • 3 讨论

  • 过度剧烈的炎症反应是脓毒症发生及进展的重要病理生理学机制，全身炎症反应风暴是脓毒症恶化为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的关键因素[9]。本研究参照文献[10]及本课题组预实验结果，利用100 ng/mL的LPS孵育RAW264.7细胞24 h，建立巨噬细胞M1型极化的炎症反应模型。结果表明，RAW264.7细胞培养基中的IL-1β和IL-18浓度水平显著升高，IL-10浓度水平显著降低，提示细胞模型建立成功。

  • 黄芪是一种珍贵的传统中药，最早记录见于《神农本草经》，距今已有上千年的应用历史。在中国药典中，药用黄芪被定义为豆科植物膜荚黄芪或者蒙古黄芪的干燥根。其中，AS-Ⅳ作为一种四环三萜类皂，是黄芪最重要的单体成分，已被证实对脓毒症引起的多种重要脏器损伤具有一定的改善作用[11-13]。因此，参照本课题组前期发表文献[4]，本研究利用浓度为200 μg/mL的AS-Ⅳ作为干预手段，以LPS孵育开始即刻作为AS-Ⅳ干预的开始时间点。结果表明，200 μg/mL的AS-Ⅳ能够显著下调巨噬细胞释放的大量IL-1β和IL-18，并且上调IL-10水平，这证实200 μg/mL的AS-Ⅳ可有效抑制LPS诱导的剧烈炎症反应。

  • 炎症因子过度释放引起的剧烈炎症反应被认为是脓毒症的重要发病机制之一，这种免疫反应失衡与多种免疫细胞如单核/巨噬细胞、中性粒细胞等的异常激活密切相关[14]。其中，巨噬细胞是一类先天性免疫细胞，是机体固有免疫的重要组成部分。当遭受病原微生物侵袭等打击时，机体微环境发生变化并诱导巨噬细胞分化为具有不同功能的表型，即为巨噬细胞极化，其在脓毒症的免疫调节中发挥重要作用，巨噬细胞极化的调控研究也被认为是脓毒症治疗的热门潜在靶点[15]。巨噬细胞的功能表型多样，其中经典激活的促炎型巨噬细胞（M1）和选择性激活的抗炎型巨噬细胞（M2）是两种主要的巨噬细胞极化表型：M1型巨噬细胞能够分泌大量炎症因子，是宿主消灭病原体的主要效应细胞，但M1型持续活化会导致严重的组织损伤；而M2型巨噬细胞则具有抗炎和组织修复等作用[16]。考虑到巨噬细胞M1/M2型极化在脓毒症炎症反应调控中的关键角色，本研究进一步探讨AS-Ⅳ对LPS诱导巨噬细胞M1/M2极化表型变化的影响。结果表明，LPS处理的巨噬细胞中M1极化标志物CD86和CD11c的mRNA水平以及CD86（+）细胞的比例显著升高，M2极化标志物CD206和Arg-1的mRNA水平以及CD206（+）细胞的比例显著降低，而AS-Ⅳ则能够有效下调CD86和CD11c并且上调CD206和Arg-1的mRNA水平，下调CD86（+）细胞的比例且上调CD206（+）细胞的比例，提示AS-Ⅳ对LPS所致炎症反应的抑制作用可能与其下调巨噬细胞M1型极化并上调M2型极化水平有关。

  • NLRP3炎症小体在脓毒症诱发的免疫炎性反应中发挥着重要作用[5]。作为巨噬细胞胞浆内的模式识别受体，NLRP3能够在细菌和内毒素等伤害性信号的刺激下，能够与ASC发生相互衔接，并能够进一步募集pro-caspase-1形成大分子蛋白复合物，即为NLRP3炎症小体[17]。近年来多项研究证实，NLRP3炎症小体能够通过介导巨噬细胞发生M1型极化从而促进炎症反应的发生[6-8]。本研究在发现AS-Ⅳ对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的改善作用与抑制巨噬细胞M1型极化、促进M2型极化的基础上，进一步探讨NLRP3炎症小体在AS-Ⅳ调控巨噬细胞M1/M2型极化中的作用。结果发现，在LPS处理的巨噬细胞中，NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达水平显著升高，表明NLRP3炎症小体可能参与促进巨噬细胞M1型极化并抑制M2型极化的发生与进展过程；而AS-Ⅳ干预则能够显著下调巨噬细胞中NLRP3、ASC和caspase-1的高表达水平，提示AS-Ⅳ可能是通过抑制NLRP3炎症小体激活来发挥对巨噬细胞M1/M2表型极化的调控作用。

  • 综上所述，AS-Ⅳ能够减轻LPS/诱导的巨噬细胞炎症反应，其机制可能与下调NLRP3炎症小体表达，从而下调巨噬细胞M1型极化水平并上调M2型极化水平有关。

  • 参考文献

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图1 流式细胞术测定RAW264.7细胞中CD86（+）细胞和CD206（+）细胞百分比的情况

图2 Western blot法测定RAW264.7细胞中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达情况

表1 三组巨噬细胞的细胞因子水平比较

表2 三组细胞的巨噬细胞极化表型标志物mRNA表达水平比较

表3 三组细胞的巨噬细胞极化表型标志物细胞百分比水平的比较

表4 三组细胞的NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平比较

图表 1/1

  • 基本信息

    中图分类号: R282；R631
    文献标识码: A
    DOI: 10.3969/j.issn.1007-6948.2024.06.026

    基金信息

    国家自然科学基金青年项目（82102248）；

    稿件历史

    收稿日期: 2024-04-11

  • 参考文献

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