血管内膜增生（intimal hyperplasia，IH）是血管损伤后动脉重构的主要并发症，然而，内皮细胞损伤、成纤维细胞激活、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）不受控制的迁移、增殖及分化和大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积会导致内膜过度增生，从而导致管腔变窄，最终导致动脉粥样硬化、心脑血管介入术后支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）等多种血管疾病的发生^[1]。目前普遍认为VSMCs的表型转换及炎症是血管IH发病机制中的关键事件。

本课题团队前期运用益气通络方的临床研究证实，益气通络方能够显著改善临床症状性颅内动脉粥样硬化性狭窄患者的中医证候，改善患者相对脑血流量；在疗效机制方面，可能通过降低血清超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP-9）的水平，抑制局部炎症反应及斑块内新生血管的生成，进而起到减缓动脉粥样硬化进展和稳定斑块的作用^[2]。此外，本研究团队前期的一项体外实验显示，益气通络方可通过上调磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路，促进抗凋亡蛋白表达，抑制细胞凋亡途径，减轻氧化应激反应^[3]。但益气通络方对于脑血管介入术后可能的血管IH作用尚不清楚。因此，本研究利用球囊导管术损伤大鼠颈总动脉血管，建立血管内膜增生模型，以益气通络方功效为基础，探讨益气通络方抗血管IH的作用，并从VSMCs表型转化和增殖方面研究其可能作用机制，旨在揭示其抗血管IH的有效性，为临床合理运用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物及主要材料

1）SD雄性大鼠36只，6周龄，体质量（350±10）g。购于北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证号：SCXK（京2016-0011）。正常饲养于北京中医药大学逸夫科研楼动物房（SPF级），1周后进行实验。动物实验经北京中医药大学学术委员会实验动物伦理分委员会批准（批准号：BUCM-4-2022090502-3065）。2）仪器：1.5 mm×15 mm医用球囊导管（北京迪玛克医药科技有限公司）、0.018英寸（1英寸=2.54 cm）×300 cm导丝（美国Boston Scientific公司）、医用球囊扩张压力泵（北京中医药大学东方医院导管室）；全景切片扫描仪（型号：PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000）、扫描浏览软件（型号：CaseViewer2.4）均购自匈牙利3DHISTECH公司、病理图像分析软件Aipathwell（Servicebio公司）。3）主要试剂：免疫组化增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（批号：10205-2-AP）、ɑ-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，ɑ-SMA）抗体（批号：55135-1-AP）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体（批号：22952-1-AP），均为proteintech公司产品，β-actin抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（批号：ab6721）为英国abcam公司产品。阿托伐他汀钙片（立普妥，辉瑞有限公司，国药准字H20051408，规格：20 mg×7片/盒，批号：8139813），碾碎溶于纯净水制备工作液（0.119 mg/mL），作为阳性药物对照组；益气通络方（药物组成：黄芪45 g，薏苡仁20 g，泽泻15 g，鳖甲15 g，地龙10 g，三七10 g，北京中医药大学东方医院购买，所有药物均来自于北京康仁堂药业有限公司），每100 g中药浓煎至100 mL后置于4℃冰箱保存。

1.2 大鼠颈动脉血管内膜增生模型的建立

参照以往文献报道的方法建立颈动脉球囊损伤模型^[4]：术前12 h禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉SD大鼠，将SD大鼠固定于手术台上，剃除其颈部皮毛，消毒，沿颈部中线偏左切开，将左侧颈总动脉直接分离，分离神经，识别颈内动脉和颈外动脉分叉，用0.5 cm微血管夹夹住颈内动脉和颈总动脉近端，用4-0缝线结扎颈外动脉远端。用眼科剪在颈外动脉斜45°切开一个“V”形开口，用导丝斜插入约3 cm深度的球囊导管，在3.0~8.0 atm的压力下扩张，并向血管分支方向旋转抽出，此动作重复3次后抽出球囊。观察血流恢复及出血情况后，逐层缝合皮肤。术后连续3 d肌内注射青霉素G（2×10⁵ U/d）预防感染。假手术组仅结扎颈外动脉，不进行球囊损伤。

1.3 动物分组及用药

将球囊损伤后的36只大鼠按照随机数字表法分为模型组、益气通络方低、中、高剂量组、阿托伐他汀组，每组6只。于造模后次日，各组开始灌胃给药，益气通络方的低、中、高剂量分别为2.07 g/d、4.14 g/d、8.28 g/d（生药计算），阿托伐他汀组给药1.19 mg/kg阿托伐他汀，模型组和假手术组灌胃等体积蒸馏水，1次/d，连续14 d。

1.4 颈总动脉病理变化的影响

14 d后处死大鼠，取损伤颈总动脉中部于4%多聚甲醛固定24 h，乙醇脱水，石蜡包埋，切片（厚4~6 μm）；按试剂盒说明书进行HE染色，于正置显微镜下观察血管病理学变化并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0分析软件对观察到的颈动脉血管图像进行定量分析，分别测量每张切片中血管管腔面积（lumen area，LA），内弹力板以内面积（internal elastic area，IELA），外弹力板以内面积（external elatic lamina，EELA），计算血管内膜面积（intimal area，IA）、中膜面积（media area，MA）、内膜面积/中膜面积、内膜厚度（intimal thickness，IT）、中膜厚度（media thickness，MT）、内膜面积增生率（hyperplasia ratio of intimal area，HRIA）、内膜厚度增生率（hyperplasia ratio of intima thickness，HRIT）。评价血管内膜增生程度。IA=IELA－LA；MA=EELA－IELA；IT=（EELA/π）½－（LA/π）½；MT=（EELA/π）½－（IELA/π）½；HRIA=IA/（IA+MA）；HRIT=IT/（IT+MT）。

1.5 免疫组织化学方法检测各组损伤段颈总动脉ɑ-SMA、OPN和PCNA蛋白的表达

取损伤段颈总动脉于4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片；60℃烤片过夜，脱蜡水化，微波抗原修复，冷却至室温，分别滴加50 μL α-SMA抗体（1︰2000）、PCNA抗体（1︰300）、OPN抗体（1︰300），操作按说明书。4℃孵育过夜；滴加HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1︰5000），37℃孵育 30 min；DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，于显微镜下观察并拍照，采用Aipathwell病理图像分析软件（Servicebio公司）进行分析，计算弱、中、强阳性细胞数量以及面积、累积光密度IOD、组织面积等不同参数，再取阳性染色面积平均数进行统计分析。

1.6 Western blot法检测颈总动脉ɑ-SMA、OPN和PCNA蛋白的表达

取各组损伤段颈总动脉，加入RIPA裂解液，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，100℃加热变性。蛋白样品经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶，室温封闭90 min；分别滴加α-SMA抗体（1︰3000）、OPN抗体（1︰3000）、PCNA抗体（1︰3000）和β-actin抗体（1︰2000），4℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1︰5000），室温孵育90 min；加入ECL化学发光液显影，采用Image J软件分析条带。

1.7 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用Tukey法检验，方差不齐用Dunnett's T3法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组颈总动脉病理变化比较

与假手术组比较，模型组IA、IT、HRIA、HRIT均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，益气通络方高剂量组及阿托伐他汀钙片组IA、IT、HRIA、HRIT均显著降低（P＜0.01）；益气通络方组与阿托伐他汀钙片组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图1、表1。

2.2 各组ɑ-SMA、OPN和PCNA蛋白表达水平比较

免疫组化结果显示，与假手术组比较，模型组颈总动脉ɑ-SMA表达显著降低（P＜0.01），OPN和PCNA表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，益气通络方低、中、高剂量组及阿托伐他汀组颈总动脉ɑ-SMA表达显著升高（P＜0.01），OPN和PCNA表达显著降低（P＜0.01，0.05）。见图2~4，表2。

2.3 各组ɑ-SMA、OPN和PCNA蛋白表达水平比较

Western blot结果所示，与假手术组比较，模型组颈总动脉ɑ-SMA表达显著降低（P＜0.01），OPN和PCNA表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀钙片组OPN表达显著降低（P＜0.01）；益气通络方高剂量组ɑ-SMA表达显著升高（P＜0.01），OPN和PCNA表达显著降低（P＜0.05）；益气通络方中剂量组ɑ-SMA表达显著升高（P＜0.01），PCNA表达显著降低（P＜0.05）。见图5。

注：^a与假手术组比较，P＜0.05，^b与模型组比较，P＜0.05

注：^a与假手术组比较，P＜0.05，^b与模型组比较，P＜0.05

3 讨论

目前，ISR仍是介入治疗的主要障碍，是介入术后非手术性缺血事件的常见原因^[5]。ISR的机制尚未明确，当前认为，血管IH是其基本病理机制^[6]，与内皮功能障碍与损伤、血小板聚集与血栓形成、VSMCs增殖-凋亡失衡、向内膜迁移、表型转换、炎症反应及合成大量ECM等多种因素有关^[7-8]。目前，现代医学综合多种手段的防治方法较多，但缺乏大规模临床试验和相应指南。中医药防治ISR的理论及方药较少，而中药及复方具有多成分、多靶点、多途径的整体调节作用，可从血管内膜增生的多个环节发挥干预作用。因此，从中医药中寻找抗血管内膜增生的有效治疗方法具有重要的科学意义。

正常的大动脉由三层环状结构组成：内皮细胞组成的内膜、多个VSMCs层组成为主的中膜和ECM为主的外膜。脑血管介入术引起的血管壁损伤及免疫排斥反应等，一方面导致内皮细胞脱落，抑制内皮细胞迁移和增殖，血管壁内皮修复延迟，另一方面刺激VSMC从分化型转化为去分化型（此即表型转化），从血管中膜迁移到内膜，并在内膜进一步增殖，合成和分泌大量的ECM，形成新生内膜^[9]。本研究中的HE结果显示假手术组大鼠血管内弹力膜完整，呈单层，未见明显增生；模型组血管内膜呈均一或不均一增厚，并有大量增生的VSMCs存在，排列紊乱，内膜增生明显；各给药组血管内膜呈增生性改变，但增生程度较模型组减轻。

VSMCs在维持血管张力和完整性、维持血管稳态等方面发挥重要作用。VSMCs的过度增殖及表型转化是多种血管重构疾病的的共同病理过程，是IH引起斑块形成和血管再狭窄的主要原因^[9]。VSMCs是动脉血管壁中的主要细胞类型，具有收缩表型，表达α-SMA、平滑肌22α（smooth muscle protein 22 α，SM22α）、平滑肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain，SMMHC）等VSMCs特异性收缩标志物，可在生理条件下维持正常的血管结构和功能。为了应对应激或血管损伤，收缩性VSMCs可以切换到分化程度较低的状态（合成表型），以获得组织修复的增殖、迁移和合成能力，表达OPN、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、MMP-9、波形蛋白（Vimentin，VIM）等合成型标志物^[10]。PCNA是调节DNA合成的重要核蛋白，其表达和合成水平与细胞增殖相关，一直被用作增殖或再生的标志物^[11]，增生内膜中PCNA的表达主要反映VSMCs的增殖情况。本研究免疫组化及Western blot结果均显示，模型组颈总动脉中VSMCs收缩表型的标志物α-SMA表达降低，合成表型标志物OPN和细胞增殖标志物PCNA表达升高，表明在血管狭窄模型中，VSMCs活化，由收缩表型向合成表型转化增多，细胞向内膜迁移并增殖，促进新生内膜的形成；与模型组比较，益气通络方及阿托伐他汀能够上调ɑ-SMA表达水平，下调OPN和PCNA表达水平，且益气通络方高剂量组对α-SMA、OPN、PCNA表达水平的影响优于阿托伐他汀钙片。提示益气通络方在球囊导管损伤过程中对血管内膜增生的抑制作用可能与VSMCs表型转化和增殖有关，具体机制有待深入研究。

综上所述，益气通络方可有效降低球囊损伤后大鼠颈总动脉新生内膜的管腔狭窄，抑制VSMCs表型转化和增殖，益气通络方可能是一种有前景的预防ISR发展的药物。

参考文献