便秘是老年人群的常见病和多发病，临床表现为大便干结，排便费时费力，小便频数^[1]。便秘会使机体产生焦虑、抑郁等不良精神压力，亦可伴有不同程度的睡眠障碍^[2]，且患者在用力排便时，会出现冠状动脉和脑血流改变，时刻影响患者的生存质量^[3]。古人治疗腹泻有“利小便以实大便之法”。受此启发，本课题组前期在全国老中医药专家林爱珍教授的临床研究中发现采用“益肠通秘”“缩泉润肠”治疗老年便秘疗效确切^[4-5]。基于此考虑老年便秘存在“大肠主津”功能的异常，临床中在此理论的指导下用药使多数患者获益^[6-7]。

随着对水通道蛋白（aquaporin，AQP）研究的不断加深，其在肠道水分转运和传输方面的作用被认知。相关研究发现，AQP3、AQP4和AQP8对结肠组织的水分吸收发挥重要作用，且AQP表达异常会导致结肠对水分的吸收紊乱诱发便秘^[8]。本研究探讨中药益肠通秘方对老年便秘模型大鼠结肠组织中AQP3、AQP4、AQP8表达的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级24月龄老年雄性SD大鼠40只，体质量（450±50）g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2017-0012。饲养于湖北中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室，均放在代谢笼中独立饲养，每笼5只。室内温度（25±5）℃，湿度（55±10）%，昼夜循环（12 h︰12 h），适应饲养1周，24 h自由饮水。

1.2 药物

中药为益肠通秘方（颗粒剂）自拟经验方：肉苁蓉15 g，牛膝10 g，当归10 g，升麻10 g，生地黄15 g，制首乌10 g，生白术20 g，枳实10 g，麻仁15 g，黄芪10 g共10味中药对应生药量的散装免煎颗粒组成，且经湖北省中医院药剂科鉴定，符合2015年版《中华人民共和国药典》的标准。成人每日生药是125 g，服药方法是早晚开水冲服。本实验中予以开水冲泡后浓缩成100 mL混悬液，对应的生药量为1.25 g/mL，制成益肠通秘方混悬液，放-20℃冰箱备用，使用前取出，预热至室温。乳果糖口服液（Abbott Healthcare Products B.V.进口药品注册证号：H20120387）；复方地芬诺酯片（吉林万通药业集团郑州万通复升药业股份有限公司生产，国药准字：H41025629）。

1.3 试剂和仪器

10 %活性炭（德国QIAGEN公司，型号：10043）；P物质（SP）及血管活性肠肽（VIP）ELISA检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-E08358r）；阿拉伯树胶（泰安市利达胶业有限公司进口分装）；PCR仪（型号：ProFlex）、RNA提取液Trizol（货号：12183555）购自赛默飞世尔科技中国有限公司；2×Taq PCR MasterMix试剂盒（货号：PC1120）、100 bp Ladder DNA marker（货号：YZ-M-DNA-100BP）、50×TAE缓冲液（货号：T1060）均购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖（货号：9012-36-6）、DEPC水（货号：7732-18-5）购自Sigma-Aldrich公司；抗-AQP3抗体（货号：ab125219）、抗-AQP4抗体（货号：ab128906）、抗-AQP8抗体（货号：ab133667）、cDNA合成试剂盒（货号：ab185916）均购自英国Abcam公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒（博士德生物技术有限公司，货号：AR0197）；研钵（郑州华丰化学仪器实验有限公司）；低速离心机（货号：E1520）、高速冷冻离心机（货号：E2720）、移液器（货号：E6651）、DEPC处理后EP管（货号：FCL12）均购自碧云天生物科技有限公司；电泳槽（型号：1658001）、电泳仪（型号：1658002）购自美国Bio-Rad公司；鼓风干燥箱（天津市美特斯试验机厂，型号：DHG-9243A）；电子天平（德国Sartorius公司，型号：Secura）；石蜡切片机（德国Lecia公司，型号：RM2125RTS）。

1.4 模型制备

将30只老年大鼠，以复方地芬诺酯混悬液灌胃2周以复制便秘模型，用量按10 mg/（kg·d）计算。与正常老年大鼠相比，老年便秘模型大鼠毛发粗糙暗淡无光泽，精神不振，体质量较正常老年大鼠轻，粪便部分羊屎状，以上可初步判断老年便秘模型大鼠复制成功。

1.5 动物分组与给药方法

取30只老年便秘模型大鼠，按照随机数字表随机分为模型组、乳果糖组、中药组，每组10只，并设置空白对照即正常组10只。中药组：依据《中药药理研究方法学》^[9]中的人体临床用药与实验动物用药计算公式折算中药给药剂量，按照动物与人用药量的换算系数表将益肠通秘方换算为相应的动物用药剂量即生药10.53 g/（kg·d），将制备的益肠通秘方混悬液蒸馏水稀释成生药含量1.05 g/mL，按照1 mL/100 g体质量灌胃，每天1次，连续2周。乳果糖组：将乳果糖口服溶液用蒸馏水稀释为18%的溶液，1.8 mL/（kg·d）的方式，按照1 mL/100 g的体质量灌胃，每天1次，连续2周。正常组、模型组连续2周予以灌胃生理盐水（1 mL/100 g的体质量）。

连续2周给药完成后，禁食不禁水12 h，用10%的活性炭悬液2 mL灌胃，待30 min后在大鼠麻醉状态下颈椎脱臼法处死大鼠。经腹部正切口，快速取幽门至肛门的肠管，结肠中的粪便颗粒及远端结肠组织，备用。

1.6 观察项目及方法

1.6.1 粪便含水量

分别记录造模后和药物治疗后的粪便含水量，将结肠取出的粪便颗粒采用电子天平称重，后置于150℃的烘烤箱内干燥15 min后称重。粪便含水率（%）=[（烘烤前粪便质量－烘烤后粪便质量）/烘烤前粪便质量]×100%。

1.6.2 肠道炭末推进试验

取出大鼠从幽门到直肠末端的全部肠管，平铺于玻璃平片上，在无张力状态下测量其总长度及活性炭混悬液推进的长度，炭末推进率（%）=（炭末推进长度/肠管总长度）×100%。

1.6.3 苏木精-伊红（HE）染色

将远端结肠组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成5 μm切片。采用二甲苯离体和梯度乙醇复水后，用HE染色试剂盒进行组织病理学检查。观察经药物治疗后大鼠结肠组织的形态学改变。用配备了dfc450c数码相机的徕卡DMIL显微镜拍摄（德国韦茨拉尔的徕卡微系统）。

1.6.4 实时荧光定量PCR检测AQP3、AQP4、AQP8 mRNA表达水平

取小块结肠组织约0.4 mg，加入0.8 mL Trizol，采用高速组织研磨仪进行组织匀浆，按照Trizol试剂盒说明书提取组织的RNA。采用逆转录试剂盒加入反应物，逆转录合成cDNA。内参选用GAPDH，各因子检测引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（见表1）。依据相关的步骤对PCR仪器进行设置：95℃预变性15 min，按95℃ 8 s，60℃ 20 s，进行45次重复。每个样品做3次重复检测。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件，符合正态分布的计量数据均以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，多组间比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠粪便含水率比较

造模后：与正常组比较，其他各组大鼠粪便含水率明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明便秘模型复制成功。给药后：与模型组比较，中药组、乳果糖组大鼠粪便含水量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；且中药组大鼠粪便含水量明显高于乳果糖组（P＜0.05）。说明益肠通秘方可以增加老年便秘模型大鼠的粪便含水率，见表2。

注：^a与正常组比较，P＜0.05；^b与模型组比较，P＜0.05；^c与乳果糖组比较，P＜0.05

2.2 各组大鼠肠道传输功能比较

与正常组比较，模型组大鼠炭末推进率明显降低（P＜0.05），说明大鼠结肠蠕动减慢，粪便传输时间延长，便秘模型造模成功；予以药物干预后，与模型组比较，各组大鼠炭末推进率明显增加（P＜0.05）；中药组和乳果糖组大鼠炭末推进率无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠结肠组织HE染色结果

模型组大鼠结肠组织肌层厚度减轻，黏蛋白数量减少，肠屏障结构受到破坏，经益肠通秘方中药治疗后明显恢复。见图1。

2.4 各组老年大鼠结肠中AQP3、AQP4、AQP8 mRNA比较

与正常组比较，模型组大鼠结肠中AQP3、AQP4、AQP8 mRNA表达量明显升高（P＜0.05）；给药后，与模型组比较，中药组、乳果糖组大鼠结肠AQP3、AQP4、AQP8 mRNA表达量明显降低（P＜0.05）；且中药组大鼠结肠AQP3、AQP4、AQP8 mRNA表达量明显低于乳果糖组（P＜0.05）。

注：^a与正常组比较，P＜0.05；^b与模型组比较，P＜0.05；^c与乳果糖组比较，P＜0.05

3 讨论

3.1 大肠主津理论在老年便秘临床中的应用

祖国医学将便秘归属于“大便难”“肠结”等范畴^[10]。老年功能性便秘是疾病慢性发展的结果，初期以脾胃受损、肠道燥热为主，长时间口服寒凉泻下之品，消化道津液输布紊乱；老年气血亏虚、肾阳不足，气虚则传导无力，血虚则失去荣养，阳虚则阴寒内生。《诸病源候论》“肾脏受邪，虚则不能制小便，则小便利，津液枯燥，肠胃干涩，故大便难”^[11]。故老年功能性便秘多归纳为肾阳虚弱、精津不足，临床上单纯口服泻药治疗重其标而失其本。《脾胃论》有言：“大肠主津，小肠主液，大肠、小肠受胃之荣气，乃能行津液于上焦，灌溉皮肤，充实腠理”^[12]。大肠为传导之官，在传导糟粕的过程中对水分进行重吸收，在机体水液代谢过程中发挥重要作用，影响大便的便质及排出。古人云利小便以实大便，则二便分消，津液走小便则大便实，泄泻自止^[13]。反之，缩小便则津液走大便，以截流聚源，增强行舟之效，便秘自消。故老年功能性便秘的治疗应在大肠主津的理论指导下，以温补肾阳、增精津，润肠通便为主。林爱珍教授团队在老年性便秘的临床工作中已取得了明确疗效^[14-16]。

3.2 便秘模型大鼠微观机制及与大肠主津理论的关系

结肠的主要功能是吸收水分和电解质，形成粪便，且分泌足够的黏液充分润滑肠道促进大便的排出；若不及时排便，结肠对粪便中的水分重吸收使粪便变干变硬，出现便秘^[17]。本研究在大肠主津理论指导下，予以复方地芬诺酯造模，结果显示大鼠粪便含水率及炭末推进率明显降低，提示便秘模型复制成功。益肠通秘方可以增加老年便秘模型大鼠的粪便含水率及炭末推进率，促进肠蠕动改善便秘，进而验证大肠主津，且津行则肠动。

AQP是一种存在于细胞膜上的、属于膜主体内在的蛋白，可以介导自由水分子的跨生物膜转运^[18]。肠黏膜上皮细胞质膜中含有较多AQP，对肠道中水分子的高效转运发挥着传送带作用，以维持细胞内外水平衡。目前在哺乳动物体内己发现13种水通道蛋白^[19]，其中AQP3、AQP4、AQP8存在于结肠并在肠道水液分泌与吸收中发挥重要作用。周薇^[20]用番泻叶对大鼠灌胃复制出不同程度的腹泻模型，且腹泻程度越重，AQP3的表达量越低，说明AQP3表达量与肠道水分重吸收密切相关。王晓玲^[21]等在建立功能性便秘的小鼠模型中发现便秘组小鼠升结肠、降结肠中AQP4的表达量均高于对照组，推测AQP4的表达量增加会引起肠道内水分的重吸收增加导致粪便含水量下降，引起便秘。王月^[22]等研究表明番泻叶可致结肠黏膜炎性损伤，使结肠组织中AQP8蛋白表达水平下降，水分吸收减少而致腹泻。以上相关研究报道表明AQP3、AQP4和AQP8影响着肠道水液转运、代谢，且与便秘的出现存在一定的相关性。在大肠主津理论的指导下，本研究结果显示便秘模型组大鼠结肠组织中AQP3、AQP4和AQP8 mRNA高表达，大鼠结肠组织对肠道水分吸收过度，便秘造模成功。AQP3、AQP4和AQP8是细胞膜上跨膜运输水、甘油和尿素等小分子物质的转运蛋白，益肠通秘方中含益气生津促动力的药物，可以使结肠组织降低对水分的过度吸收并释放水分子，维持细胞内外的水平衡，提高肠道内粪便含水量，同时可加快肠道蠕动，达到改善和治疗便秘。

从形态学来看，便秘模型组大鼠结肠含水津液减少，组织肌层厚度减轻，黏蛋白数量减少，肠屏障结构受到破坏，经益肠通秘方治疗后明显恢复，亦可从组织学佐证大肠主津，津液输布与便秘相连。从大肠津液输布代谢方面展现了便秘的一部分发生机制，为临床中从大肠主津方向调整机体功能改善便秘提供理论依据和实验依据。

3.3 益肠通秘方遣方用药分析

基于大肠主津的理论，以温阳益气、增补津精、润肠通便为遣方配伍原则。方中生地黄壮水生津，润养肠道，为大肠津液之源。当归补血，津血同源，补血以生津，可滋养肠道；当归活血，滑动肠道，可用于肠燥便难。肉苁蓉、牛膝、制首乌三者均入肾经，肾为水脏，主宰津液，肾阳的蒸腾气化推动大肠津液输布，主要采用其温补肾阳、增益精血、滋润肠道之效。生白术、枳实相互配伍可宽肠下气通便。火麻仁归脾胃经，可用于津液亏虚之便秘，同时可刺激肠壁，加快肠道蠕动。黄芪补气，气能生津，可益津液，增补水液通道，气行则肠动，促进肠蠕动。升麻上举阳气，可向上宣发肾气，肾气上扬，亦可助当归养血生津之功。同时防止上升太过，配伍牛膝发挥下行之效。益肠通秘方从津走大肠为起点，疏通各脏腑的气血、阴阳，津液通则便秘通。本方未使用大量疏通缓泻之药，在遣方中融合升扬亦有降、滋补亦有泄，以达生津、温阳、通便之效。

综上所述，益肠通秘方在老年便秘模型大鼠中作用明确，其主要作用机制能够快速恢复肠道组织病理形态学的损伤，通过调控结肠黏膜AQP3、AQP4、AQP8水平提高粪便含水量，从而改善便秘情况。

参考文献