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肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是来源于肾小管上皮细胞的腺癌，是一种最常见的肾癌病理亚型，约占肾癌的60%~85%[1]。ccRCC通常在50岁以后发病，男性患病率高于女性[2]。在病理上，西医通常将肾癌分为4类：透明细胞型肾癌、颗粒细胞型肾癌、混合细胞型肾癌、未分化细胞型肾癌。虽然近年来手术、靶向药物和免疫疗法显著提高了肾癌患者的总体生存率，但ccRCC患者仍有较高的复发率和侵袭性，导致病死率较高[3]。因此，揭示ccRCC的分子机制并寻找新的治疗靶点具有重要意义。
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锌指蛋白28（ZFP28）是一种Cys2-His2型锌指蛋白家族成员，作为转录抑制因子，ZFP28通过结合基因启动子区域的特定DNA序列，调控基因的表达水平[4]。ZFP28在多种组织中表达，并参与细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程[5]。研究表明，ZFP28可以通过与特定的启动子序列结合来调节基因表达，并在多种细胞过程中发挥重要作用[5]。在ccRCC中，炎症反应和细胞代谢是促进肿瘤进展的两个关键因素[6]。然而，ZFP28在ccRCC中的作用和机制尚未明确。本研究通过检测ZFP28在ccRCC细胞模型中的表达及功能，特别是其对细胞代谢和运动能力的影响，旨在探讨ZFP28对于ccRCC的影响及其机制，阐明其作为ccRCC潜在治疗靶点的可行。
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1 材料与方法
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1.1 细胞株
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人肾透明细胞癌786-O细胞与人正常肾近端小管的上皮细胞系HK-2购自美国典型培养物保藏中心（American type culture collection，ATCC），使用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃，5%CO2条件下培养。
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1.2 主要实验试剂
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一抗ZFP28（ab108931）、基质金属酶（MMP）-2（ab92536）、MMP-9（ab76003）、蛋白激酶B（AKT）（ab8805）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）（ab8933）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）（ab1349033）、p-mTOR（ab109268）、β-actin（ab8226）购自美国Abcam公司。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自中国碧云天公司，PI/FITC Annexin V凋亡检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司，DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、胰酶（Trypsin-EDTA）均购自美国Gbico公司，葡萄糖摄取检测试剂盒（ab136955）、Edu检测试剂盒（222421）购自英国Abcam公司，硝酸纤维素膜（Polyvinylidene Fluoride，PVDF）购自美国Millipore公司。siRNAs购自广州锐博公司。Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司。
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1.3 主要仪器
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蛋白电泳仪（Mini-Protean 3 Cell）、转膜系统（Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell）购自美国Bio-Rad公司，荧光显微镜（IX73）购自日本Olympus公司，流式细胞仪（FACSCalibur）、蛋白成像系统（ChemiDoc XRS+）购自美国BD Biosciences公司，酶标仪（Multiskan FC）购自美国Thermo Fisher公司。
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1.4 实验方法
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1.4.1 细胞转染
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786-O细胞使用Lipofectamine3000进行siRNAs转染，转染方法参照转染试剂说明书进行。转染48 h后进行后续功能实验。将786-O细胞进一步分组为未转染组（对照组）、转染阴性对照siRNA组（si-NC组）及转染ZFP28 siRNA组（si-ZFP28组）。
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1.4.2 定量聚合酶链反应（qPCR）检测ZFP28 mRNA水平
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使用Trizol试剂（日本TaKaRa公司）提取组织和细胞总RNA。然后用逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）逆转录总RNA。采用SYBR Ex Taq™II（日本TaKaRa公司）进行定量PCR检测。使用的引物如下：ZFP28：正向5’-CCGGGAACGTGACGAAAGT-3’，反向5’-CTGAGGTTGAGCCTTGAGCA-3’；GAPDH：正向5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反向5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。
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1.4.3 CCK-8实验
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将786-O细胞接种于96孔板中孵育（500个/孔）。然后用CCK-8溶液维持培养细胞4 h，利用分光光度计测定OD450值。
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1.4.4 集落形成实验
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将786-O细胞接种于6孔板中培养（500个/孔），14 d后，用4% PFA固定细胞，0.2%结晶紫染色。用德国蔡司显微镜LSM710采集图像。
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1.4.5 Edu实验
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将786-O细胞接种于24孔板中孵育（2000个/孔）。在完成相应的转染和药物处理后，培养24 h，Edu检测试剂盒孵育，随后定量统计Edu阳性细胞百分数。
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1.4.6 ATP合成实验
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使用ATP试剂盒（中国碧云天公司），根据制造商的方案测定786-O细胞的ATP含量。
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1.4.7 葡萄糖摄取实验
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将786-O细胞接种于24孔板中培养，并通过葡萄糖摄取检测试剂盒（美国Sigma公司）测定葡萄糖摄取率。
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1.4.8 细胞凋亡实验
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将786-O细胞用70%乙醇在-20℃固定2 h。随后在4℃用PI和FITC Annexin V染色，用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest Pro 5.1测量细胞凋亡水平。
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1.4.9 Transwell实验
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将细胞接种于transwell（美国BD公司）上室。随后，孵育底室以刺激迁移（不含基质）或入侵（含10%基质）。24 h后，弃去上室的细胞培养基及未迁移细胞。剩余细胞使用4% PFA固定20 min，0.2%结晶紫染色。统计单位视野中侵袭细胞的个数，共测量5个不同视野，取平均数。
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1.4.10 免疫印迹实验
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将786-O细胞裂解提取蛋白。蛋白样品通过SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上。蛋白质用5%牛奶封闭1 h，然后加入相应的一抗，于4℃过夜孵育。ZFP28（1∶500稀释）、MMP-2（1:500稀释）、MMP-9（1∶1000稀释）、p-AKT（1∶1000稀释）、AKT（1∶1000稀释）、p-mTOR（1∶500稀释）、mTOR（1∶500稀释）、β-actin（1∶3000稀释），然后孵育二抗1 h，使用增强型化学发光试剂（ECL）显影，并用蛋白成像系统拍照。
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1.5 统计学方法
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采用GraphPad软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 ZFP28在ccRCC细胞中高表达
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免疫印迹方法检测结果显示，与HK-2细胞相比，786-O细胞中ZFP28蛋白表达水平显著上调（图1A）。qPCR检测结果也显示，786-O细胞中ZFP28 mRNA水平显著高于HK-2细胞（图1B）。
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图1 ZFP28在肾透明细胞癌细胞中高表达
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2.2 ZFP28下调抑制786-O细胞生长
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免疫印迹分析显示，ZFP28的下调（si-ZFP28组）明显减少了786-O细胞中的ZFP28蛋白水平（图2A）。CCK-8检测发现，ZFP28的下调显著降低了786-O细胞存活率，OD450值降低（图2B）。集落形成实验结果显示，ZFP28的下调明显降低了786-O细胞的集落形成数量，表明细胞生长被抑制（图2C）。Edu实验显示，ZFP28的下调显著降低了786-O细胞的Edu阳性细胞比例，表明细胞生长被抑制（图2D）。流式细胞实验结果显示，ZFP28下调加速了786-O细胞的凋亡（图2E）。
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图2 ZFP28下调对786-O细胞生长的抑制情况
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2.3 ZFP28的下调抑制786-O细胞的代谢反应
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ATP合成实验和葡萄糖摄取实验发现，ZFP28的下调显著抑制了786-O细胞的葡萄糖摄取和ATP产生（图3A、3B）。免疫印迹实验证实，下调ZFP28能进一步抑制786-O细胞葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达（图3C）。因此，ZFP28的下调抑制786-O细胞的代谢反应。
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2.4 ZFP28下调抑制786-O细胞的运动能力
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Transwell实验表明，ZFP28的下调抑制了786-O细胞的迁移和侵袭能力，迁移和侵袭细胞数量明显减少（图4A）。ZFP28的下调也抑制蛋白标志物MMP-2和MMP-9的表达，进一步提示细胞迁移及侵袭被抑制（图4B）。
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2.5 ZFP28下调抑制AKT/mTOR通路
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免疫印迹分析显示，ZFP28下调降低了786-O细胞中AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平，提示ZFP28对AKT/mTOR通路的抑制（图5）。
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图3 ZFP28下调抑制786-O细胞的代谢反应
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图4 ZFP28下调阻断了786-O细胞运动能力
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图5 ZFP28下调抑制786-O细胞中AKT和mTOR的表达和磷酸化水平
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3 讨论
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在ccRCC的病理机制中，肾癌细胞的代谢反应和迁移能力扮演了关键角色。这些细胞在ccRCC中表现出过度活化状态，产生大量的代谢介质，如葡萄糖和ATP，这些介质不仅加剧局部和系统性的代谢反应，还促进疾病的持续性和进展[7]。肾癌细胞的迁移能力增强使得这些细胞能够侵入并破坏周围组织，导致功能丧失和畸形[8]。因此，调控这些细胞的代谢反应和迁移能力可以视为控制ccRCC病程和发展的潜在治疗策略[9]。
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作为一种锌指蛋白，ZFP28通过与特定DNA序列结合，影响下游目标基因的表达，包括与代谢相关的基因，如葡萄糖摄取、ATP合成和代谢介质[10]。这些基因的表达变化可能导致代谢系统活化，促使代谢反应的发生和维持[10]。在不同的疾病中，ZFP28的作用各有不同。例如，在自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮中，ZFP28可能通过调节免疫相关基因的表达来影响代谢反应[11]。在炎症性肠病如克罗恩病和溃疡性结肠炎中，ZFP28可能参与了肠道屏障功能的调控，并通过改变免疫系统的反应来加剧炎症。在癌症中，ZFP28可能通过影响炎症微环境来促进肿瘤的发生和发展。在癌症中，ZFP28可能通过影响代谢微环境来促进肿瘤的发生和发展。此外，ZFP28在代谢疾病如糖尿病中也可能发挥重要作用，通过调节胰岛素敏感性和脂肪组织的代谢反应来影响疾病进程[12]。因此，揭示ZFP28在代谢和不同疾病中的具体机制对于寻找新的治疗靶点和开发新的治疗方法具有重要意义[12]。本研究发现，ZFP28在ccRCC细胞中高表达，并且ZFP28的下调可以明显抑制这些细胞的增殖、代谢反应和迁移能力。这些发现提示ZFP28可能通过影响AKT/mTOR通路来调节ccRCC相关的病理过程。
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AKT/mTOR通路在细胞的增殖、分化、迁移和代谢中起到关键作用。AKT通过激活一系列下游分子，如mTOR和FOXO，调节细胞的生长和生存[13]。mTOR作为AKT的下游信号分子，以mTORC1和mTORC2的形式存在。mTORC1通过磷酸化S6K1和4EBP1，促进蛋白质合成和细胞生长，而mTORC2则参与调控细胞骨架和迁移能力[13]。
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本研究观察到下调ZFP28能够抑制AKT的磷酸化，减少其活化状态，进而抑制mTORC1和mTORC2的信号传导[14]。具体表现为AKT和mTOR的磷酸化水平下降，暗示蛋白质合成和细胞增殖受到抑制，表明细胞迁移能力减弱[14]。ZFP28通过与AKT/mTOR通路相关的mRNA结合，促进其降解，从而抑制该信号通路的活性。这与ZFP28作为RNA结合蛋白的已知功能相一致。
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本研究也存在一些局限性。首先，本研究主要依赖于体外细胞模型，未能完全模拟ccRCC患者微环境的复杂性。此外，本研究观察到ZFP28下调影响了多种细胞功能，但具体通过哪些下游分子和途径介导这些效应仍需要进一步研究。最后，未来研究应考虑使用动物模型来验证这些体外发现，并评估靶向ZFP28治疗ccRCC的可能性和安全性。
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综上所述，ZFP28可能通过调节AKT/mTOR信号通路改善ccRCC，从而介导细胞的增殖、代谢和迁移。ZFP28可以作为一个有希望的ccRCC治疗靶点。
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摘要
目的：探讨锌指蛋白28（ZFP28）对肾透明细胞癌（ccRCC）细胞增殖、代谢、运动的影响及其机制。方法：免疫印迹和qPCR检测786-O和HK-2细胞中ZFP28的表达。CCK-8、集落形成、Edu、ATP合成、葡萄糖摄取、流式细胞术检测细胞的增殖及代谢能力；免疫印迹显示ZFP28对AKT/mTOR通路的影响；Transwell实验揭示对细胞迁移与侵袭的影响。结果：ZFP28在ccRCC细胞中与正常肾近端小管的上皮细胞系HK-2相比高表达（P＜0.05）。通过siRNA导致的ZFP28下调抑制786-O细胞的生长与集落形成、ATP合成和葡萄糖摄取，并抑制786-O细胞的迁移及侵袭（P＜0.05）。ZFP28下调在ccRCC细胞中抑制786-O细胞的AKT/mTOR通路（P＜0.05）。结论：ZFP28通过AKT/mTOR轴抑制ccRCC细胞的生长、代谢和运动，可作为ccRCC治疗的潜在靶点。
Abstract
Objective To investigate the influence of ZFP28 on proliferation, metabolism, and motility of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) cells, along with its underlying mechanism. Methods Immunoblotting and qPCR were employed to assess the expression of ZFP28 in 786-O cells and HK-2 cells. Cell proliferation and metabolism capacity were determined using CCK-8 assay, colony formation, Edu, ATP synthesis assay, glucose uptake assay, and flow cytometry. The impact on the AKT/mTOR pathway was evaluated through immunoblotting, while Transwell assays were conducted to reveal effects on cell migration and invasion. Results ZFP28 was highly expressed in ccRCC cells compared with normal proximal renal tubule epithelial cell line HK-2 (P＜0.05). Down-regulation of ZFP28 by siRNA inhibited the growth, colony formation, ATP synthesis and glucose uptake of 786-O cells, and inhibited the migration and invasion of 786-O cells (P＜0.05). ZFP28 down-regulated the AKT/mTOR pathway of 786-O cells in ccRCC cells (P＜0.05). Conclusion ZFP28 inhibits the growth, metabolism, and motility of clear cell renal cell carcinoma cells through the AKT/mTOR axis, suggesting its potential as a therapeutic target for ccRCC.
Keywords
Clear cell renal cell carcinoma ； ZFP28 ； 786-O ； cellular metabolism ； AKT/mTOR
