-
膀胱癌是全球最常见的癌症之一。在诊断时，大约75%的患者为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscular invasive bladder cancer，NMIBC）。经尿道肿瘤切除术（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）是临床治疗NMIBC的主要手段，但术后近期复发率可高达50％～70%[1]。基于NMIBC低分级、低进展和高复发率的生物学特性，膀胱腔内免疫佐剂和化疗药物灌注已成为TURBT术后预防与治疗NMIBC复发的首选方案。
-
目前，膀胱内灌注卡介苗（BCG）主要用于T1G3膀胱癌TURBT或肿瘤整块切除术后，是预防与治疗肿瘤复发与进展的首选免疫治疗药物。由于BCG是一种活的结核分枝杆菌，其具有严重的局部与全身毒副作用，使大约25%以上的患者不能完成灌注治疗疗程，且药物短缺、费用昂贵。膀胱腔内灌注化疗药物适用于低危NMIBC术后预防肿瘤复发，由于膀胱灌注化疗药物产生的化学性膀胱炎引起的严重下尿路综合征（lower urinary tract syndrome，LUTS）[2]、排尿疼痛，不仅影响了患者对长期维持灌注的依从性，而且也存在耐药、免疫逃逸等相关问题。鉴于此，对低危NMIBC行TURBT术后，研究一种安全有效、患者依从性好，预防与治疗TURBT术后肿瘤复发的创新药物，是临床亟需研究的重要课题。
-
消痔灵注射液是以中药五倍子为主要成分的中药复合制剂，具有固涩、脱水、硬化脱落、纤维化的作用，临床上主要用于痔疮、血管瘤、腋臭等治疗。近20年来，不断有文献报道消痔灵注射液用于肿瘤领域特别是针对膀胱癌治疗的研究成果[3-5]。本课题组前期研究表明，消痔灵注射液对膀胱癌细胞生长有显著的抑制作用，可能与其阻断细胞增殖周期及诱导癌细胞凋亡有关[6]。传统中药五倍子的化学成分主要是鞣质酸，其中单宁酸占其重量的50%~70%[7]，是具有多种生物活性的单体。近年来，单宁酸作为抗癌剂[8-9]广泛用于肝癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12-13]、胰腺癌[14]、结肠直肠癌[15]和卵巢癌[16]等治疗，但单宁酸注射液对膀胱癌细胞是否具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭作用以及其作用机制，尚不清楚。本研究通过观察单宁酸对膀胱癌EJ细胞和T24细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响及其作用机制，为临床提供一种新的膀胱腔内灌注抗癌药物的研究与开发应用奠定基础。
-
1 材料和方法
-
1.1 材料
-
人膀胱癌EJ细胞购自于武汉华联科生物技术有限公司，人膀胱癌T24细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。RPMI-1640、PBS缓冲液购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（FBS）、10% SDS-PAGE凝胶超快速配制试剂盒、SDS-PACE蛋白上样缓冲液（5×）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；TBS缓冲液、结晶紫染色液、10×RealBlot快速转膜液、羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP购自北京兰杰柯科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；RIPA组织/细胞快速裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；一抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、半胱氨酸蛋白酶7（Caspase7）、神经型钙粘蛋白（N-cadherin）、上皮型钙粘蛋白（E-cadherin）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、波形蛋白（Vimentin）、蜗牛家族转录抑制因子1（SNAI1）、甲酸相关孤儿核受体C蛋白（RORC）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）购自武汉三鹰生物技术有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、0.25% Trypsin-EDTA购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；单宁酸购自于上海麦克林生化科技有限公司。
-
1.2 实验仪器
-
CO2培养箱（美国SHELLAB公司）；CX-31型倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；低温离心机（美国赛洛捷克）；酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）；显影仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。
-
1.3 实验方法
-
1.3.1 细胞培养
-
将人膀胱癌EJ细胞及T24细胞使用RPMI-1640培养基进行培养；培养基中含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素，细胞放置在保持37℃（含5％浓度CO2）的细胞培养箱中培养。
-
1.3.2 CCK-8检测细胞存活率
-
取生长状态良好的膀胱癌细胞EJ和T24，每孔1.5×103个细胞接种于96孔板，置于37℃培养箱中培养24 h，分别用0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L浓度的单宁酸处理T24细胞，用0、0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L浓度的单宁酸处理EJ细胞，每组设置6个复孔。培养细胞96 h后加入CCK-8溶液，再置于培养箱中培养40 min，取出96孔板，使用酶标仪检测每孔在波长450 nm处的吸光度值，并带入公式计算细胞增殖能力。
-
1.3.3 细胞生长计数实验检测细胞生长
-
取生长状态良好的膀胱癌细胞EJ和T24，每孔5×104个细胞接种于6孔板，置于37℃培养箱中培养24 h，加入含有相应药物浓度的单宁酸。培养细胞48 h后重悬细胞并计数，每个浓度梯度重复计数3次。
-
1.3.4 平板克隆形成实验检测细胞生长能力
-
取生长状态良好的膀胱癌细胞EJ和T24，每孔1×103个细胞接种于6孔板中，每组设置3个复孔，置于37℃培养箱中培养1周后加入相应浓度梯度药物后培养细胞1周固定染色。获得图像后记录细胞数≥50个可见菌落的数量。
-
1.3.5 细胞迁移实验（Transwell）检测细胞的侵袭能力
-
取生长状态良好的膀胱癌细胞EJ和T24，每孔2×105个细胞接种于6孔板中，每组设置1个复孔，置于37℃培养箱中培养24 h。加入相应浓度梯度药物后继续培养48 h消化离心后，按照每孔4×104个细胞加入Transwell小室中，保持上室2％胎牛血清，下室10％胎牛血清培养24 h，后使用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色后镜下拍照。
-
1.3.6 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力
-
取生长状态良好的膀胱癌细胞EJ和T24，每孔5×105个细胞接种于6孔板中，置于37℃培养箱中培养24 h，确定细胞铺满后使用200 μL无菌枪头划线并加入相应浓度梯度的单宁酸，培养48 h，分别在0 h、24 h、48 h期间随机选取5个视野，镜下拍照并计算划痕愈合率。
-
1.3.7 Western Blot检测单宁酸对核受体蛋白及凋亡蛋白、转移蛋白表达的影响
-
除去各组细胞培养液，于冰上裂解细胞，离心，将上清液放入离心管中，BCA检测蛋白总浓度，电泳并调节蛋白浓度一致，30 μL样本量上样，转移至PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶进行封闭，取出PVDF膜，并用1×TBST溶液洗膜，按照1︰1000稀释c-PARP1、c-Caspase7、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP2、SNAI1、RORC、GAPDH一抗，4℃孵育过夜。TBST溶液洗涤后，加入1︰3000稀释的二抗室温孵育，仪器显影曝光，分析各组的蛋白表达水平。
-
1.4 统计学分析
-
采用SPSS 20.0软件分析数据，数据用均数±标准差表示，多组间比较采用F检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
-
2 结果
-
2.1 单宁酸对膀胱癌细胞半数抑制浓度的确定
-
用单宁酸处理EJ、T24细胞后浓度效应曲线显示：17.74 μmol/L和20.16 μmol/L分别为EJ、T24细胞的半数抑制浓度（图1）。后续实验分别采用0、6.25、12.5、25 μmol/L和0、5、10、20 μmol/L 浓度梯度进行EJ和T24细胞相关实验。
-
图1 CCK-8法检测加入单宁酸后各组细胞的吸光度值变化及半数抑制浓度
-
2.2 单宁酸对膀胱癌细胞生长增殖的影响
-
与对照组（0 μmol/L）比较，单宁酸可显著抑制EJ、T24细胞的生长，随着单宁酸浓度梯度升高，细胞数量呈梯度下降趋势（P＜0.05，图2）。
-
图2 细胞计数检测单宁酸处理后各组存活细胞数量变化
-
通过克隆形成实验发现，加入单宁酸能够显著抑制膀胱癌细胞的存活。与对照组相比，单宁酸组EJ、T24细胞的生长明显受到抑制，集落形成数量明显减少，且呈剂量依赖性（P＜0.05，图3）。
-
图3 平板克隆实验检测单宁酸处理后各组细胞的克隆数量变化
-
2.3 单宁酸对膀胱癌细胞侵袭能力的影响
-
与对照组比较，单宁酸组EJ、T24细胞的侵袭能力明显下降，呈剂量依赖性（P＜0.05，图4）。
-
图4 Transwell实验检测单宁酸处理后各组细胞的侵袭能力变化
-
2.4 单宁酸对膀胱癌细胞迁移能力的影响
-
与对照组相比，随着时间变化，膀胱癌EJ、T24细胞划痕愈合率随单宁酸浓度梯度增加而呈递减趋势（P＜0.05，图5）。
-
图5 细胞划痕实验检测单宁酸处理后各组细胞的迁移能力变化
-
2.5 单宁酸对膀胱癌细胞凋亡蛋白、转移蛋白及核受体蛋白的影响
-
单宁酸处理膀胱癌细胞EJ、T24后，N-cadherin、MMP2、Vimentin及SNAI1蛋白表达水平均低于对照组，而c-PARP1、c-Caspase7、E-cadherin、RORC蛋白表达水平高于对照组，均呈剂量依赖性（P＜0.05，图6-8）。
-
图6 单宁酸处理后各组细胞凋亡蛋白表达水平变化
-
图7 单宁酸处理后各组细胞转移蛋白表达水平变化
-
图8 单宁酸处理后各组细胞核受体蛋白表达水平变化
-
3 讨论
-
从传统中药中挖掘具有抗癌活性的小分子单体，已成为膀胱肿瘤研究领域的热点问题。尽管这些小分子活性单体在临床前研究中显示出积极的抗肿瘤作用，如萝卜硫素[17]、黄芩苷[18]等天然小分子化合物已被证明可抑制膀胱肿瘤的发生发展，但由于其水溶性较低、药代动力学较差和周围神经系统毒性等原因，导致针对膀胱癌的创新药物研发和临床应用仍然面临着巨大的挑战。
-
单宁酸是消痔灵主要的活性成分，文献报道其具有促进细胞凋亡、增强顺铂抗癌作用的功效[10]，提示单宁酸与消痔灵抗膀胱肿瘤效应可能存在一定的关联性。本研究通过CCK-8实验发现，单宁酸可呈剂量依赖性抑制膀胱癌EJ细胞、T24细胞的活力，半数抑制浓度分别为17.74 μmol/L和20.16 μmol/L，后续实验均围绕该浓度展开。在细胞计数和细胞平板克隆实验中发现低浓度的单宁酸对膀胱癌细胞的生长克隆能力即有抑制作用，且随着药物浓度的提高抑制作用也不断加强。Transwell侵袭实验和划痕实验均显示单宁酸能够抑制膀胱癌细胞的侵袭及迁移能力。c-PARP1、c-Caspase7是细胞凋亡的关键蛋白，本研究通过Western Blot实验发现，与对照组相比，单宁酸能诱导剪切型凋亡蛋白c-PARP1、c-Caspase7表达，说明单宁酸能促进膀胱癌细胞凋亡。N-cadherin、E-cadherin、MMP2、Vimentin及SNAI1蛋白是细胞转移的经典蛋白，N-cadherin、MMP2、Vimentin及SNAI1蛋白是促进转移蛋白，E-cadherin是抑制转移蛋白。与对照组相比，单宁酸处理膀胱癌EJ细胞、T24细胞的E-cadherin蛋白表达显著升高，N-cadherin、MMP2、Vimentin及SNAI1的蛋白表达显著下降。说明单宁酸能够抑制膀胱癌细胞的转移能力。
-
RORC是核孤儿受体家族的一员，在多种恶性肿瘤的细胞增殖、转移和化疗耐药中发挥着关键的调节作用。RORC表达增强可抑制细胞增殖和葡萄糖代谢，并增加顺铂诱导的体外和体内细胞凋亡。Cao等[19]发现RORC的表达水平与人类膀胱癌患者的预后呈负相关。增强的RORC通过抑制PD-L1启动子活性来抑制细胞生长和代谢重编程，并进一步灭活 PD-L1/ITGB6/FAK/AKT/STAT3 信号传导。本研究利用单宁酸梯度干预发现RORC的蛋白表达水平高于对照组，提示RORC可能是抑制膀胱癌细胞EJ、T24的增殖及转移能力的调控因子。
-
综上所述，本课题组通过前期研究提出了单宁酸可能是抑制膀胱癌细胞的单体，通过体外实验验证了单宁酸可以抑制膀胱癌细胞的增殖及迁移侵袭能力，并发现RORC参与调控膀胱癌细胞的增殖及迁移。本研究是基于体外实验探讨单宁酸对膀胱癌细胞的作用，初步证实RORC调控膀胱肿瘤的增殖及迁移，后续将通过更加深入的机制研究及体内实验予以验证，为后期的临床前研究提供依据。
-
参考文献
-
[1] 蒋斌,狄奇,贺潇,等.马归液联合吉西他滨治疗非肌层浸润型膀胱癌术后的临床观察[J].湖南中医药大学学报,2021,41(8):1275-1279.
-
[2] 蒋翡翎,单保恩.卡介苗治疗膀胱癌的免疫机制与研究进展[J].中国热带医学,2005,5(3):640-642.
-
[3] 秦庆亮,马雪银,曹桂红,等.局部注射消痔灵治疗胃癌[J].第四军医大学学报,2000,21(8):961-963.
-
[4] 杨金祖,杨金坤,顾伟,等.消痔灵注射液肝动脉灌注治疗大鼠移植性肝肿瘤的实验研究[J].上海中医药杂志,2005,39(7):48-49.
-
[5] 江少波.局部注射“消痔灵注射液” 治疗膀胱肿瘤的分析[J].浙江临床医学,2001,3(10):750.
-
[6] 周洁,李国浩,侯菁,等.消痔灵注射液对膀胱癌EJ细胞生长抑制作用研究[J].中国中西医结合杂志,2020,40(11):1350-1355.
-
[7] Yang K,Jian SY,Wen CY,et al.Gallnut tannic acid exerts anti-stress effects on stress-induced inflammatory response,dysbiotic gut microbiota,and alterations of serum metabolic profile in beagle dogs[J].Front Nutr,2022,9:847966.
-
[8] Gao JY,Yang X,Yin WP,et al.Gallnuts:a potential treasure in anticancer drug discovery[J].Evid Based Complement Alternat Med,2018,2018:4930371.
-
[9] Zhang TT,Chu JP,Zhou XD.Anti-carious effects of Galla chinensis:a systematic review[J].Phytother Res,2015,29(12):1837-1842.
-
[10] Geng NN,Zheng X,Wu MS,et al.Tannic acid synergistically enhances the anticancer efficacy of cisplatin on liver cancer cells through mitochondria-mediated apoptosis[J].Oncol Rep,2019,42(5):2108-2116.
-
[11] Nie FY,Liang Y,Jiang B,et al.Apoptotic effect of tannic acid on fatty acid synthase over-expressed human breast cancer cells[J].Tumour Biol,2016,37(2):2137-2143.
-
[12] Pattarayan D,Sivanantham A,Krishnaswami V,et al.Tannic acid attenuates TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition by effectively intervening TGF-β signaling in lung epithelial cells[J].J Cell Physiol,2018,233(3):2513-2525.
-
[13] Sp N,Kang DY,Kim DH,et al.Tannic acid inhibits non-small cell lung cancer(NSCLC)stemness by inducing G(0)/G(1)cell cycle arrest and intrinsic apoptosis[J].Anticancer Res,2020,40(6):3209-3220.
-
[14] Chauhan SS,Shetty AB,Hatami E,et al.Pectin-tannic acid nano-complexes promote the delivery and bioactivity of drugs in pancreatic cancer cells[J].Pharmaceutics,2020,12(3):285.
-
[15] Yang P,Ding GB,Liu W,et al.Tannic acid directly targets pyruvate kinase isoenzyme M2 to attenuate colon cancer cell proliferation[J].Food Funct,2018,9(11):5547-5559.
-
[16] Sun YY,Zhang TH,Wang BD,et al.Tannic acid,an inhibitor of poly(ADP-ribose)glycohydrolase,sensitizes ovarian carcinoma cells to cisplatin[J].Anticancer Drugs,2012,23(9):979-990.
-
[17] Zuo MS,Chen HC,Liao YJ,et al.Sulforaphane and bladder cancer:a potential novel antitumor compound[J].Front Pharmacol,2023,14:1254236.
-
[18] Kong N,Chen XY,Feng J,et al.Baicalin induces ferroptosis in bladder cancer cells by downregulating FTH1[J].Acta Pharm Sin B,2021,11(12):4045-4054.
-
[19] Cao DL,Qi ZH,Pang YY,et al.Retinoic acid-related orphan receptor C regulates proliferation,glycolysis,and chemoresistance via the PD-L1/ITGB6/STAT3 signaling axis in bladder cancer[J].Cancer Res,2019,79(10):2604-2618.
-
摘要
目的：探讨中药五倍子提取物单宁酸对膀胱癌EJ细胞和T24细胞的增殖、迁移和侵袭作用及其机制。方法：采用CCK-8、细胞计数实验方法检测不同浓度的单宁酸对膀胱癌EJ细胞和T24细胞增殖的抑制作用，应用平板克隆、细胞划痕和Transwell实验方法检测单宁酸对EJ和T24细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，Western Blot实验检测单宁酸对膀胱癌EJ和T24细胞凋亡、转移及维甲酸相关孤儿核受体C蛋白（RORC）的表达作用。结果：不同浓度的单宁酸对膀胱癌EJ细胞、T24细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性（P＜0.05），EJ和T24细胞增殖、迁移、侵袭能力随着单宁酸浓度增加而降低（P＜0.05）；单宁酸上调膀胱癌EJ和T24细胞的凋亡相关蛋白c-PARP1、c-Caspase7以及E-cadherin的表达；同时下调转移相关蛋白N-cadherin、MMP2、Vimentin、SNAI1的表达；EJ和T24细胞凋亡相关蛋白的表达与RORC的上调相关。结论：单宁酸通过上调RORC表达抑制膀胱癌EJ、T24细胞的增殖及迁移侵袭作用。
Abstract
Objective To investigate the effects of tannic acid from gallnut extract on proliferation, migration and invasion of EJ cells and T24 cells of bladder cancer and its mechanism. Methods CCK-8 and cell counting assay were used to detect the inhibitory effect of tannic acid at different concentrations on the proliferation of EJ and T24 cells. Plate cloning, cell scratch and Transwell assay were used to detect the effects of tannic acid on the proliferation, migration and invasion of EJ and T24 cells. The effects of tannic acid on apoptosis, metastasis and expression of retinoic acid-associated orphan nuclear receptor C protein (RORC) in bladder cancer EJ and T24 cells were detected by Western Blot assay. Results Tannic acid at different concentrations inhibited the proliferation of EJ and T24 cells in a dose-dependent manner (P＜0.05), and the proliferation, migration and invasion of EJ and T24 cells decreased with the increase of tannic acid concentration (P＜0.05). Tannic acid up-regulated the expression of apoptosis-related proteins c-PARP1, c-Caspase7 and E-cadherin in bladder cancer EJ and T24 cells. Meanwhile, the expression of transfer-related proteins N-cadherin, MMP2, Vimentin and SNAI1 was down-regulated. The expression of EJ and T24 apoptosis-related proteins correlated with the up-regulation of RORC. Conclusion Tannic acid inhibited the proliferation and migration of bladder cancer cells EJ and T24 by up-regulating RORC expression.
关键词
单宁酸 ； 膀胱癌 ； 增殖 ； 迁移与侵袭 ； 维甲酸相关孤儿核受体C蛋白
Keywords
Tannic acid ； bladder cancer ； propagation ； migration and invasion ； RORC
