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急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）在临床和实验研究均可同时表现为胰腺外分泌和内分泌功能障碍[1-2]。患者常因腹痛、腹胀、呕吐等胰腺外分泌功能受损症状寻求医疗救助，但通常也伴有血糖升高和胰岛素分泌减少而导致胰腺内分泌损伤[1]。临床研究证实，血糖升高与 AP 的严重程度有关，并可影响疾病进展和恢复[3-4]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一种由肠道内分泌 L-细胞合成的肠促生长素，对于维持正常血糖稳态至关重要[5-6]，但其在 AP 发生和发展的过程中合成和分泌的变化仍不清楚。
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大承气汤治疗 AP 的疗效确凿，近年来对其作用机制也有所阐明[7-8]。然而，目前的研究主要集中在大承气汤减轻胰腺炎症和改善胰腺外分泌功能，其对胰腺内分泌功能的影响尚不清楚。本研究在检测 AP 大鼠 GLP-1 分泌变化的同时，观察大承气汤对胰腺内分泌功能的改善作用，并初步探讨其作用机制。
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1 材料和方法
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1.1 动物
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48 只 SPF 级的雄性 Wistar 大鼠（200~220 g）购自北京斯贝福生物技术有限公司（SCXK 京 2019-0010）。所有大鼠饲养于温度、湿度恒定，有 12 h 光/暗循环的环境，自由进食、饮水。所有实验均按照动物护理委员会的动物护理和处理指南进行，实验方案经天津医科大学动物伦理与福利委员会批准（审批号：TMUaMEC2018031）。
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1.2 大承气汤制备
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大承气汤由大黄、厚朴、枳实、芒硝组成，各项配比为 4：5：4：3。所有原料均来自安国龙联中药有限公司。将厚朴（15 g）和枳壳（12 g） 加入 8 倍体积的水中煮沸 30 min，煎煮 20 min 时加入大黄（12 g），结束后直接用煮沸的药汤冲入芒硝 （9 g）。最后，在 80℃下将汤剂浓缩至 2.0 g/mL。
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1.3 模型制备及药物处理
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经过 7 d 的适应性饲养后，按照随机数字表法将 48 只大鼠随机分为对照组、AP 组和 AP+大承气汤（DCQD）组，每组 16 只。采用腹腔内注射雨蛙素（10 μg/mL，5 0 μg/kg 体质量，上海 Sigma-Aldrich 公司）诱导 AP 模型[9]。两次注射间隔为 0.5 h，共注射 6 次。对照组仅注射生理盐水。AP+DCQD 组大鼠在第一次注射前 3 h 和最后一次注射后 9 h 予以大承气汤 （4.8 g/kg 体质量，相当于临床等效剂量的 2 倍）灌胃。实验期间大鼠自由进食和饮水。在最后一次注射后的 6、12 和 24 h，经内眦取血，测定葡萄糖、淀粉酶、C 肽、胰岛素和 GLP-1 水平。于最后一次注射后 12 h 麻醉大鼠，取胰腺和回肠组织进行 HE 染色、免疫组化检测和酶联免疫吸附试验（ELISA）。
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1.4 检测血糖、淀粉酶、胰岛素、C 肽和 GLP-1 水平
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用深圳迈瑞 BS-350E 全自动生化分析仪测定血糖浓度和血清淀粉酶活性。按 ELISA 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）操作手册测定血清胰岛素、C 肽及血清、回肠和胰腺的 GLP-1 水平。
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1.5 组织病理学和评分
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胰腺和回肠的组织样品包埋在石蜡中，切成 4 μm 厚的切片，常规 HE 染色，并由 2 名研究人员以盲法进行分级。根据先前描述的标准进行胰腺组织病理学评分[9]。通过测量软件 Digimizer 测量绒毛高度，每个标本观察 5 个切片，每个切片测量 5 个绒毛并计算平均值。
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1.6 免疫组化染色
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切片脱蜡至水，用 3%H2O2 处理后，在柠檬酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.0）中孵育 10 min，并用磷酸盐缓冲溶液洗涤。抗 GLP-1 抗体 （稀释液 1:500，货号：ab23468，美国 Abcam 公司）在室温下孵育 1 h，抗小鼠 IgG H&L（稀释液 1:1000，货号：ab207996，美国 Abcam 公司）孵育 30 min，链霉亲和素辣根过氧化物酶孵育 30 min。最后，用 3，3-二氨基联苯胺底物处理。高倍镜下每个切片至少检测 6 个视野，使用 Image J、Fiji 软件进行 GLP1 蛋白表达的半定量测定，并计算每个样本中阳性细胞的平均数量。
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1.7 统计学方法
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采用 SPSS 17.0 统计软件分析研究数据。计量数据以 表示，多组比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 大承气汤改善胰腺组织病理学损伤
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AP 组大鼠模型诱导后 12 h，显微镜下观察到胰腺外分泌部间质水肿，可见腺泡细胞胞质外漏、斑点状坏死及炎症细胞浸润，胰岛与腺泡的边界模糊，部分胰岛呈不规则形状，但胰岛细胞未见明显形态学损伤；而 AP+ DCQD 组大鼠胰腺组织病理学损伤有所减轻。AP 组大鼠胰腺组织间质水肿、炎性浸润、实质坏死和出血评分均较对照组升高（P<0.05）；与 AP 组比较，AP+ DCQD 组大鼠的间质水肿、炎性浸润、实质坏死和出血评分降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。
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图1 大承气汤改善 AP 大鼠胰腺组织病理学损伤（HE，×200）
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2.2 大承气汤降低大鼠血清淀粉酶活性和血糖浓度
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AP 组大鼠血清淀粉酶活性和血糖浓度在 6 h、 12 h 和 24 h 较对照组升高（P<0.05）。与 AP 组比较，AP+DCQD 组大鼠血清淀粉酶活性和血糖浓度均降低，差异有统计学意义（P <0.05），见图2。
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图2 大承气汤降低 AP 大鼠血清淀粉酶活性和血糖浓度
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2.3 大承气汤提高血清胰岛素、C 肽和 GLP-1 水平
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AP 组大鼠在 6 h、12 h 和 24 h 的血清胰岛素、 C 肽和 GLP-1 水平均低于对照组（P <0.05）；与 AP 组比较，AP+DCQD 组大鼠在 6 h、12 h 和 24 h 的血清胰岛素、C 肽和 GLP-1 水平升高，差异有统计学意义（P <0.05），见图3。
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图3 大承气汤提高血清胰岛素、C 肽和 GLP-1 水平
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2.4 大承气汤增加大鼠回肠和胰腺的GLP-1含量
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AP 大鼠回肠和胰腺组织 GLP-1 含量较对照组降低 （P <0.05）；与 AP 组比较，AP+DCQD 组回肠和胰腺组织 GLP-1 含量升高，差异有统计学意义（P <0.05），见图4。
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图4 大承气汤增加回肠和胰腺的 GLP-1 含量
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2.5 大承气汤改善回肠组织病理学损伤
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AP 诱导后 12 h，在显微镜下观察到回肠黏膜肠绒毛排列不规整，扭曲倒伏、形态各异，肠黏膜上皮细胞变性、坏死并脱落，绒毛上皮与固有层出现增宽的 Gruenhagen’s 间隙，可见炎症细胞浸润；AP+DCQD 组回肠组织病理学损伤减轻。与对照组比较，AP 组大鼠绒毛高度显著降低（P <0.05）；与 AP 组比较， AP+DCQD 组回肠绒毛高度增加，差异有统计学意义（P <0.05），见图5。
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2.6 大承气汤促进大鼠回肠 GLP-1 蛋白表达并保护 L-细胞
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大承气汤促进大鼠回肠 GLP-1 蛋白表达并保护 L-细胞与对照组比较，AP 组大鼠回肠 GLP-1 的蛋白表达水平降低，L-细胞数量减少（P <0.05）； 与 AP 组比较，AP+DCQD 组 GLP-1 蛋白表达增加， L-细胞数量增加（P <0.05），见图6。
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图5 大承气汤改善 AP 大鼠回肠组织病理学损伤（HE，×200）
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图6 大承气汤保护 AP 大鼠回肠 L-细胞并促进 GLP-1 蛋白表达（免疫组织化学染色，×200）
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3 讨论
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血糖升高在 AP 发作期间和 AP 发生后很常见。最近的一项研究显示，AP 首次发作的患者在住院期间空腹高血糖的发生率为 45.3%[10]。高血糖通常被认为是与应激相关的一种短暂的 AP 并发症，然而越来越多的研究表明，大约 23%~45%的 AP 伴有高血糖患者在出院后 5 年内发展为糖尿病[11-12]。上述研究表明，AP 期间的高血糖与 AP 后的糖尿病之间存在未知的内在联系。还有研究发现，血糖升高会使 AP 继发性感染更加难以控制，引发胰岛素抵抗，从而形成恶性循环，导致并发症出现并增加死亡率[3]。因此，保护胰腺内分泌功能，将血糖控制在正常水平是治疗 AP 的重要策略。
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大承气汤源于张仲景的《伤寒论》，是治疗 AP 的有效药物。研究发现，大承气汤能抑制炎症反应，并保护肠屏障，减少炎症因子的产生和经肠淋巴途径的移位，进而改善重症急性胰腺炎相关性肺损伤[13-14]。还有研究利用网络药理学筛选出 71 个活性成分[15]，其中大黄的主要活性成分大黄素在动物和细胞实验均可通过抑制炎症信号通路来减轻胰腺损伤[16]。本项研究结果证实，大承气汤除了降低 AP 大鼠血清淀粉酶活性、减轻胰腺病理损伤外，还对胰腺内分泌功能有保护作用。
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胰岛素是反映β-细胞功能的经典生物标志物，C 肽从胰岛素原上裂解，产生的量与胰岛素相等，但其半衰期比胰岛素长（20~30 min vs 3~5 min）[17]。因此，本研究同时测定血清胰岛素和 C 肽，来反映内源性胰岛素的分泌水平，并评价胰腺内分泌功能。结果发现，AP 模型大鼠的血糖升高，血清胰岛素和 C 肽水平下降；大承气汤治疗可促进 AP 大鼠胰岛素分泌，维持血糖在正常水平，说明大承气汤除了减轻炎症反应、改善胰腺外分泌功能以外，对 AP 引起的胰腺内分泌功能也有保护作用。
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β-细胞分泌胰岛素受 GLP-1 的调节，GLP-1主要由肠黏膜的肠内分泌 L-细胞合成和分泌，并通过体循环运输至胰腺以刺激胰岛素的分泌。当血糖浓度降低至正常水平时，L-细胞将暂停产生 GLP-1，胰岛素分泌也随之中断[18]。因此，GLP-1 在维持糖代谢平衡方面发挥着重要作用，已成为治疗 2 型糖尿病最有潜力的药物[19]。本研究发现，AP 大鼠血清、胰腺和回肠的 GLP-1 水平同时降低，表明 GLP-1 的产生和运输减少，而大承气汤的治疗则促进了 GLP-1 的产生以及其向胰腺的输送。
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肠屏障功能障碍是 AP 最常见的并发症，一项荟萃分析显示，59%的 AP 患者有肠屏障损伤，导致肠道细菌和内毒素移位，发生多器官功能障碍综合征[20]。本研究结果除了证实 AP 伴随回肠病理损伤外，还发现位于黏膜层的肠内分泌 L-细胞总数和 GLP-1 表达也减少，从而导致 GLP-1 的合成减少； 而大承气汤的治疗可减轻肠黏膜破坏，并通过增加 L-细胞的数量和上调 GLP-1 蛋白表达来促进 GLP-1 的合成。
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综上所述，本研究表明肠内分泌-L 细胞在 AP 发生时受到破坏，导致 GLP-1 的产生减少。大承气汤治疗 AP 可改善胰腺内分泌功能障碍，降低血糖浓度，其作用机制包括减轻胰腺和回肠的病理损伤，保护肠黏膜内分泌 L-细胞，并促进 GLP-1 的产生、分泌和运输，进而刺激胰岛素分泌。
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摘要
目的：探讨大承气汤对急性胰腺炎（AP）内分泌功能的影响及其可能机制。方法：采用腹腔注射雨蛙素诱导大鼠 AP 模型，在第一次注射雨蛙素前 3 h 和最后一次注射雨蛙素后 9 h 分别给予大承气汤灌胃。随后动态分析大鼠血糖和血清淀粉酶、胰岛素、C 肽和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的水平，采用 HE 染色观察胰腺和回肠的组织病理学变化，采用免疫组化法检测回肠表达 GLP-1 的阳性细胞，并用 ELISA 法检测胰腺和回肠的 GLP-1 含量。结果：大承气汤灌胃可显著降低 AP 大鼠血清淀粉酶活性和血糖浓度，减轻胰腺和回肠组织病理学损伤，提高血清胰岛素、C 肽、GLP-1 水平和胰腺、回肠组织 GLP-1 水平，增加回肠 GLP-1 阳性细胞数量，并上调 GLP-1 蛋白表达水平。结论：大承气汤能改善 AP 大鼠胰腺内分泌功能，其机制与保护回肠 L-细胞和促进内源性 GLP-1 分泌，进而增加胰岛素生成有关。
Abstract
Objective To investigate the effect of Dachengqi decoction (DCQD) on endocrine function and the potential mechanisms in acute pancreatitis (AP). Methods Rat AP models were induced by 6 intraperitoneal injections of caerulein in saline (50 μg/kg body weight), Dachengqi decoction (4.8 g/kg body weight) was orally given at 3 h before and 9 h after the last injection of caerulein. The blood glucose and serum amylase, the levels of insulin, C-peptide and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) were dynamically analyzed. The histopathological changes of pancreas and ileum, and the quantification of GLP-1 positive cells were observed. In addition, the GLP-1 levels in pancreas, ileum and ileal lumen were detected by ELISA. Results Dachengqi decoction treatment significantly reduced the serum amylase activity and blood glucose, alleviated the histopathological damage of pancreas and ileum. Moreover, Dachengqi decoction obviously increased the serum levels of insulin, C-peptide and GLP-1, as well as L-cells numbers of ileum in AP rats. Further determination indicated that Dachengqi decoction elevated the GLP-1 levels in the pancreas and ileum, decreased the GLP-1 level in ileal lumen. Conclusion Dachengqi decoction improves endocrine pancreatic function of AP, the mechanisms is related to protecting L-cells and raising the production of endogenous GLP-1, which in turn increases the level of insulin secreted by pancreas.
