骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨量下降、骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加的全身性骨病。传统中医学认为 OP 属“骨痿”“骨枯”“骨痹”的范畴，病因以肾虚为主，也与肝脾等密切相关。OP 的辨证分型包括肾阳虚、肝肾阴虚、脾肾阳虚和血瘀气滞四型^[1]。OP 是一种与增龄相关的疾病，我国 60 岁及以上的人口占总人口的 18.70%，老龄化问题严重，其中 65 岁以上人群 OP 患病率高达 32.0%，预计到 2050 年，我国骨质疏松性骨折的医疗支出将高达 1745 亿元^[2]。OP 导致的疼痛、脊柱变形、骨折等问题严重影响了患者的生活质量，带来了经济损失。

红芪（radix hedysari，RH）为豆科植物多序岩黄芪的干燥根，分布于甘肃六盘山和南部的山地。具有补气升阳、固表止汗、行滞通痹的功效，常用于治疗气虚乏力、半身不遂、痹痛麻木等疾病。淫羊藿 （herba epimedii，HE）为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鲜淫羊藿的干燥叶，具有补肾阳、强筋骨的作用。常用于肾阳虚衰，筋骨痿软^[3]。红芪甘温，补益肾中元气；淫羊藿，味辛、性甘温，温肾壮阳，补益精气，二者配伍，可益气温肾、助精化髓之功效，对肾阳虚及肾精不足有较好的疗效。中药配伍一般遵循“据病辨证和随症加减”的基本方法^[4]。本课题组以红芪为君药，淫羊藿为臣药进行组方，发现该方剂配伍可协同提高骨质疏松大鼠的骨密度，方剂中君药针对主证，在辨证的基础上臣药组成针对辨病^[5]。有方剂研究发现淫羊藿作为臣药可调节免疫微环境，间接影响骨代谢，黄芪作为使药作用于细胞过程^[6]。虽然红芪与黄芪有很多共同成分，但红芪中 Ca 含量更高，黄酮类活性成分种类与含量也不尽相同^[7]。由于中药成分、作用靶点较多，采用网络药理学和分子对接技术可以通过生物信息技术对大量的药物成分和靶点进行多层次、多角度分析，为后续红芪-淫羊藿药对的临床用药提供思路与依据，本研究进一步探讨红芪配伍淫羊藿治疗 OP 的机制。

1 材料与方法

1.1 红芪-淫羊藿有效成分及相关靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台数据平台 （TCMSP，https://tcmspw. com/tcmsp. php），将“淫羊藿”“红芪”作为检索对象，获取药物活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药指数（DL）≥0.18 作为筛选活性成分的标准。通过 Swiss target prediction 分析平台 （http：//www.swiss targetprediction.ch/）获取红芪-淫羊藿中（RH-HE）主要活性成分对应的潜在作用靶点，采用 UniProt Knowledge base（http://www.uniprot.org/）校正后，去重整合得到潜在作用靶点。

1.2 OP 相关靶点及药物潜在治疗靶点的获取

以 “osteoporosis”为搜索关键词，种属限定为“Homo sapiens”，通过 OMIM 数据库（https://www.omim. org）、GeneCards 数据库 （https://www. genecards. org），挖掘 OP 相关的潜在靶点，通过 DrugBank 数据库（https://go.drugbank.com），获得 OP 干预药物相应靶点。合并所有数据库靶点，删除重复值，得到与骨质疏松相关靶标。并使用 Venn2.1.0 平台（https:// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制红芪-淫羊藿有效成分靶点和 OP 靶点的韦恩图，得到两者的交集靶点。

1.3 红芪-淫羊藿治疗 OP 的药物-活性成分-共同作用靶点网络构建

运用 Cytoscape（3.10.1）软件构建红芪-淫羊藿活性成分与 OP 靶点进行关联网络，构建“药物-成分-靶点”图，进而分析红芪-淫羊藿抗骨质疏松的关键活性成分。

1.4 红芪-淫羊藿治疗 OP 的核心靶点分析

提取交集靶点输入 STRING（https://string-db.org/）数据库，蛋白种类限定为“Homo sapines”，相互作用得分 （interaction score）≥0.7 作为筛选条件构建蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）网络，去除游离节点后，导入 Cytoscape（3.10.1）软件进行网络拓扑分析，筛选出红芪-淫羊藿治疗 OP 的核心靶点。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

将靶点信息导入 DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov），进行 GO 富集分析，包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）。按 P 值升序排列，选取前 15 个 KEGG 通路制对结果分别进行可视化。

1.6 分子对接

将 5 个交集靶点最多的药物活性成分与 PPI 所得度值（degree）最高的 5 个核心靶点进行分子对接。通过 TCMSP 平台及 RCSB PDB 网站（https://www.rcsb.org/）获取活性成分及蛋白分子的 3D 结构，使用 AutoDock Tools 软件（1.5.6）对蛋白结构去水加氢、计算电荷、定义对接位点，模拟药物分子和受体蛋白相互作用，并计算结合能，最后用 PyMOL 软件将对接结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 红芪-淫羊藿有效成分及相关靶点的筛选

通过 TCMSP 平台及文献搜索，筛选出淫羊藿红芪药对活性成分共 33 个，其中 3 个活性成分为两药共有（表1）。Swiss target prediction 分析平台库共收集到红芪-淫羊藿 33 个活性成分的作用靶点 1812 个，去重后得到 538 个靶点。

2.2 OP 相关靶点及药物潜在治疗靶点的获取

通过 GeneCards、DrugBank、OMIM 数据库共获取 OP 相关靶点 2103 个，去重后最终得到疾病靶点 1831 个。将 538 个红芪-淫羊藿活性成分作用靶点与 1831 个 OP 靶点取交集，获得 146 个红芪-淫羊藿治疗 OP 的潜在靶点，见图1。

2.3 红芪-淫羊藿治疗 OP 的“药物-活性成分-共同作用靶点”网络

将红芪及淫羊藿 2 个药物，33 个活性成分 （表1），146 个潜在治疗靶点导入 Cytoscape 软件作图，得到“药物-活性成分-共同作用靶点”网络（图2），图中 degree 值越大的成分和靶点，其图形面积越大，可作为治疗 OP 的核心成分及核心靶点，其中 degree>30 的活性成分包括：S27 柚皮素、S20 甘草素、S30 甘草素 （左旋）、S14 淫羊藿 A、S18 木犀草素、S11 山柰酚、S22 槲皮素、S9 金圣草黄素、S10 异戊烯基-萘酚、S23 美迪紫檀素。

2.4 红芪-淫羊藿治疗 OP 的核心靶点分析

构建 PPI 网络，该网络有 146 个节点和 1810 条边，利用 Cytoscape 可视化后筛选出红芪-淫羊藿治疗 OP 的核心靶点（图3），degree 值越大，颜色越深，圆形面积越大。结果提示 SRC、CTNNB1、STAT3、雌激素受体 1（ESR1）、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤坏死因子（TNF）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（AKT1）、B 淋巴细胞瘤-2（BCL2）、B 细胞κ肽基因增强子核因子 1（NFKB1）、基质金属蛋白酶 9（MMP9）等靶点蛋白可能在红芪-淫羊藿治疗 OP 中起到了关键作用。

2.5 GO 富集分析与 KEGG 通路分析

GO 富集分析结果获得 633 项生物过程 （biological process，BP），主要涉及 RNA 聚合酶 II 启动子转录的正调控、信号传导、炎症反应、基因表达的正调控等。61 项细胞组分（cellular component，CC），包括质膜、细胞质、核、胞质溶胶等。138 项分子功能（molecular function，MF），显著富集在 ATP 结合、酶结合、锌离子结合蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。排名前 10 的条目绘制柱状图（图4）。KEGG 通路分析得到红芪-淫羊藿治疗 OP 的 167 条信号通路，结果显示红芪-淫羊藿可以通过调节炎症反应、MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路、细胞凋亡信号通路等通路发挥作用，取前 15 个通路绘制气泡图（图5）。

2.6 分子对接

运用 AutoDock （1.5.7）软件对红芪-淫羊藿主要活性成分[柚皮素、甘草素、甘草素 （左旋）、淫羊藿 A、木犀草素] 和关键靶点蛋白 （SRC、CTNNB1、STAT3、ESR1、EGFR）进行分子对接验证，结果见表2，结合能绝对值越大，表示受体与配体亲和力越强，大于 20.0 KJ/mol 视为有较好的结合活性，将结合能绝对值大于 35.0 KJ/mol 的构象进行可视化，见图6。

3 讨论

红芪配伍淫羊藿治疗 OP 已被证实有很好的疗效，中医理论中，红芪的益气固表和淫羊藿的补肾益精两方面共同改善骨质疏松的症状，两药配伍可发挥协同作用^[8]。本研究发现，红芪-淫羊藿治疗骨质疏松的 10 个核心活性成分（degree>30）均为黄酮类化合物，说明此类活性成分是治疗 OP 的关键成分。黄酮类化合物包含不同的结构，如黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、异黄酮等。但研究发现它们对去卵巢动物骨质流失的影响非常相似。大多数通过增加成骨细胞 （osteoblasts，OB） 生成、减少破骨细胞 （osteoclast，OC）生成而促进 OC 凋亡，以及刺激骨折部位新生血管形成来增加骨密度和骨强度^[9]。红芪中的 5 种黄酮类化合物（毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素）可以通过提高碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，促进大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC） 和 OB 的增殖^[10]。另外，其他三种黄酮类成分山柰酚、槲皮素、芦丁可以减少 Ca、P 丢失，从而减少骨流失，其中山柰酚改善骨微结构效果最好^[11]。研究还发现，4 种淫羊藿黄酮化合物（淫羊藿苷、淫羊藿 A、淫羊藿 B 和淫羊藿 C）可以改善 OP 大鼠肠道菌群和酶的活性^[12]，从而达到抗骨质疏松的作用。

本研究行 PPI 分析筛选出 SRC、CTNNB1、 STAT3、ESR1、EGFR 等关键靶点。SRC 蛋白广泛存在于组织细胞中，调控细胞的生长和分化过程。研究发现，其中 c-Src 蛋白高度活化或过量表达可促进 OP 的发生^[13]。CTNNB1 基因编码β-肌动蛋白连接蛋白（β-catenin），为 Wnt 信号通路的关键蛋白，通过调控 MSC、OC 和 OB 的分化和增殖，进而刺激骨骼的发育和代谢 ^[14]。转录激活因子 STAT3 属于 STAT 家族，STAT 信号通路是多种细胞因子、激素和生长因子的重要通路。研究表明，JAK/STAT 信号通路通过作用于关节内外骨骼部位的 OB 和 OC 来影响骨重塑，在骨骼愈合中起着重要作用^[15]。ESR1 编码雌激素受体α（ERα），ERα通过与雌激素结合促进骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的表达，并抑制核因子-κβ配体（RANKL）的作用，从而减少 OC 形成，抑制骨吸收，起到抗骨质疏松的作用^[16]。EGFR 是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体，EGFR 的高表达或异常表达与血管生成及细胞凋亡有关，EGFR 在年龄相关 OP 中起着重要作用，上调 EGFR 信号可以减少 MSC 衰老，增加皮质骨内膜表面形成，发挥抗骨质疏松作用^[17]。

通过 GO 功能富集分析及 KEGG 通路富集分析可知，MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路、细胞凋亡信号通路等通路共同发挥抗 OP 作用。MAPK 信号通路通过三级激酶级联的形式传导细胞外信号，研究发现，该通路可以调节 MSC 的生长、分化、凋亡和死亡等多种生理过程，从而起到治疗 OP 的作用 ^[18]。还有研究表明，红芪中毛蕊异黄酮通过 PI3K/AKT 信号通路发挥作用^[10]，淫羊藿总黄酮也可以通过激活 TLR4/PI3K/AKT 信号通路发挥抗 OP 的作用^[19]。其中，PI3K 促进 PIP2 变成 PIP3，PIP3 再激活 PDK1，PDK1 进一步激活 AKT/PKB。AKT/PKB 的激活对成骨细胞的增殖分化发挥重要作用。细胞凋亡信号通路则涉及诱导骨细胞的凋亡，重塑骨骼微观结构和功能，从而影响骨密度^[20]。

综上所述，本研究通过网络药理学构建“药物靶点-疾病”的网络，分析预测红芪-淫羊藿治疗 OP 的潜在活性成分及靶点，全面分析药物与生物系统之间的相互作用，揭示药物在生物体内的多成分、多靶点、多途径协同作用机制。分子对接技术基于分子间的相互作用力直观模拟了药物与蛋白之间的作用形式，以结合能的大小反映了分子对接的稳定程度。本研究为红芪-淫羊藿配伍治疗骨质疏松的后续实验研究奠定了基础。

参考文献