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血管生成在生物学过程中扮演着重要角色，涉及到胚胎发育、组织修复、创伤愈合、炎症、肿瘤生长以及慢性疾病等多个方面，其中血管化不足是组织修复不良发生的重要原因[1]。因此，探索如何有效地促进血管新生，是提高组织耐受感染能力、维持修复微环境稳态的新策略。治疗性血管新生是指通过修复、重塑或促进血管新生，使机体在缺血或缺氧等病理状态下改善其状况。在这个过程中，内皮细胞的增殖、迁移和分化是其中至关重要的环节[2]。
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中医药在治疗血管新生方面有着悠久的历史。中医理论认为，祛除瘀血有助于促进新的血管生长，而益气、活血、化瘀的中药也被证实对血管新生具有一定疗效[3]。黄芪作为补气要药，在补气固表、升阳固脱等方面发挥着关键作用[4]。黄芪甲苷 （astragaloside IV，AS-IV） 是黄芪中的主要活性成分，也是评价黄芪质量和发挥药效的关键指标之一。文献证明，黄芪甲苷对血管生成有着重要影响，主要表现在改善血管内皮功能障碍、促进血管新生方面。黄芪甲苷能够通过诱导 H 型血管形成基因的高表达来促进血管生成，从而辅助成骨过程[5-6]。黄芪甲苷干预的间充质干细胞外泌体可以显著增加血管内皮细胞的增殖、黏附数、管腔形成数以及迁移宽度[7-8]。但其具体作用机制还有待进一步深入研究。本研究旨在通过网络药理学分析和分子对接全面探讨黄芪甲苷在促进血管生成过程中的分子机制和作用途径，为其在临床应用中的合理利用提供科学依据和理论支持。
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1 资料与方法
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1.1 黄芪甲苷的靶点筛选
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通过检索 PubChem （http://www. ncbi. nlm. nih. gov/home/chemicals）获得黄芪甲苷的化学结构。通过数据库 SwissTarget Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/），Organism 选择 Homo sapients 和数据库 Genecards（http://www. genecards. org）获得黄芪甲苷的潜在作用靶点，合并相关数据去重后，得到相关靶点。
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1.2 血管生成相关靶点的获取
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以“vascularization” 为关键词，通过数据库 Genecards（http://www. genecards. org） 检索血管生成的潜在作用靶点， Organism 选择“Homo sapients”。
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1.3 黄芪甲苷促进血管生成的目的靶点获取及蛋白互作网络的构建
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通过 Venny 平台（https:// bioinfogp.cnb.csic. es/ tools/venny/index. Html） 输入黄芪甲苷和血管生成的靶点，取二者交集，得到目的靶点并绘制韦恩图。将目的靶点列表上传至String 数据库，得到蛋白互作 （protein-proteininteraction，PPI）网络图，其可显示目的靶点之间直接或间接调控关系，同时保存 PPI 网络数据为 tsv 格式，将其上传至 cytoscape3.10.1 软件进行进一步的可视化分析，依据 degree 算法得出排名靠前的核心靶点。
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1.4 目的基因的基因本体论及通路分析
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利用数据库 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）将黄芪甲苷与血管化的共有靶点基因进行基因本体论（gene ontology， GO）功能注释富集分析及京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路分析，上传至微生信平台（https://www. bioinformatics.com.cn/）做出条形图及气泡图。
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1.5 核心靶点的分子对接
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在 Pubchem 数据库 （https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. Gov） 输入关键词黄芪甲苷，获得化合物 3D 结构，在 PDB 数据库 （https：//www.rcsb. org）输入关键蛋白，筛选出合适的大分子蛋白或 AlphaFold 系统预测蛋白结构，去除水分子、提取配体、去除杂质作为受体，采用 Auto Dockvina 软件进行加氢加氧计算电荷数设定原子类型，运行 Auto Dockvina 进行分子对接，用 Pymol 软件进行受体和配体可视化处理。网络药理学分析和分子对接的流程图见图1。
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图1 网络药理学分析和分子对接的流程图
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2 结果
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2.1 黄芪甲苷及血管生成靶点筛选结果
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通过 PubChem 获得黄芪甲苷的化学结构，见图2。通过 SwissTarget Prediction 和 Genecards 数据库搜集得到黄芪甲苷的潜在作用靶点，根据置信度得分，筛选去重后，共得到 93 个药效靶点，并从 Genecards 数据库搜索得出 803 个血管生成的靶点。
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图2 黄芪甲苷的化学结构
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2.2 筛选黄芪甲苷促血管生成交集靶点及 PPI 网络
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利用 Venny 平台绘制韦恩图，共筛选出 43 个交集靶点，包括 MMP9、TGFB1、IL1B、TMX2-CTNND1、 H19、IL6、PPARG、LINC01672、CERNA3、AKT1、TUG1、 BDNF-AS、GAS5、CTNNB1、BCL2、SOD2-OT1、HIF1A、 BAX、RAC1、CDK4、SMAD3、PGR-AS1、LDLR、SMAD2、 NOTCH3、GSK3B、PVT1、MIR214、LINC02605、PROCR、 MIR320A、NOX4、MIR146B、HSP90AA1、VEGFA、FGF1、 FGF2、HPSE、LGALS3、ADRA1A、AKT2、STAT3、MET，见图3A，并将靶点列表上传至 String 数据库，得到 PPI 网络图，见图3B。借助 Cytoscape3.10.1 软件，忽略与主网络无连接点的靶点，最终得到 28 个节点、 224 条边的 PPI 网络。根据 degree 值筛选出前 10 的靶点 （degree 值均≥20），包括 IL6、AKT1、MMP9、 STAT3、TGFB1、CTNNB1、HIF1A、BCL2、GSK3B、 IL1B，见图3C。
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图3 黄芪甲苷和血管生成的交集靶点及 PPI 网络图
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2.3 筛选黄芪甲苷促血管生成交集基因及 PPI 网络
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利用 DAVID 数据库将黄芪甲苷与血管化的共有靶点基因进行 GO 功能注释富集分析，导入微生信平台做出条形图，与生物过程相关的基因多集中在基因表达的负调控、细胞增殖的负调控、蛋白磷酸化的正调控、细胞迁移的正调控、细胞增殖的正调控，与细胞组分相关的基因多分布在核浆、转录因子复合体、细胞表面等方面，与分子功能相关的基因多涉及到酶结合、蛋白磷酸酶结合、转录因子结合、 RNA 聚合酶所有序列特异性 DNA 结合、泛素蛋白连接酶结合等，见图4。利用 DAVID 数据库将黄芪甲苷与血管化的共有靶点基因进行 KEGG 功能注释富集分析，导入微生信平台，做出气泡图，得到富集显著的 20 条信号通路，包括与糖尿病并发症形成相关的 AGE-RAGE 信号通路，与胃癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、肾细胞癌等癌症相关的信号通路， PI3K-Akt 信号通路，与动脉粥样硬化、疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、麻疹、非酒精性脂肪肝、乙型肝炎、Th17 细胞分化相关信号通路等，见图5。
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图4 黄芪甲苷与血管生成交集基因 GO 富集分析
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图5 黄芪甲苷与血管生成交集靶点 KEGG 富集分析
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2.4 核心靶点的分子对接
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将 PPI 网络图中度值较高的核心靶点 IL6、AKT1、MMP9、STAT3、TGFB1、 CTNNB1、HIF1A、BCL2、GSK3B、IL1B 作为受体，以黄芪甲苷作为配体进行分子对接，见表1。从结果中选取与黄芪甲苷对接能量均小于-8 kcal/mol 的 4 个靶点（AKT1、GSK3B、HIF1A、MMP9）行可视化分析，黄芪甲苷可以与 AKT1 的 LEU-295、LYS-276及 ASN-279 形成氢键，黄芪甲苷可以与 GSK3B 的 ARG-414、VAL-135、ASN-186、ASP-200、LYS-183 形成氢键，黄芪甲苷可以与 HIF1A 的 LYS-297、 ARG-170、TRP-189、HIS-229、ASN-232 形成氢键，黄芪甲苷可以与 MMP9 的 GLU-47、ARG-51、ASP182、ARG-370、LYS-184、ASP-207、GLY-340 形成氢键，见图6。
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图6 AKT1、GSK3B、HIF1A、MMP9 与黄芪甲苷分子对接的可视化分析
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3 讨论
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黄芪甲苷作为中药黄芪的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎和免疫调节等多方面作用。其能有效促进血管再生，在器官损伤和伤口愈合方面表现出良好的治疗效果，主要机制包括：1）促进内皮细胞分化、增殖及迁移，加速新生血管形成；2）减少血管生成过程中的氧化应激和炎症反应[9]。
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本研究确定了 43 个黄芪甲苷促进血管生成的潜在靶点，根据相互作用网络节点的度值，进一步获取前 10 个关键治疗靶点，包括 IL6、AKT1、MMP9、 STAT3、TGFB1、CTNNB1、HIF1A、BCL2、GSK3B、IL1B，分子对接显示黄芪甲苷对这些靶标有良好的亲和力。AKT1 是丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种组织中表达，在细胞代谢、生长、增殖和生存中发挥着核心调控作用[10]。HIF1A 为缺氧诱导因子，在缺氧条件下可以维持细胞的内环境稳态，使机体适应缺氧[11]。文献表明，在心肌组织中，黄芪甲苷可以上调 AKT1 和 HIF1A 水平，上调 VEGFA 的蛋白表达，促进内皮样细胞分化及增殖、迁移[12]。当在炎症发生时，IL1B 和 MMP9 表达常同步变化，协同参与细胞焦亡，MMP9 不但能降解细胞外基质成分，还能调控如受体、黏附分子和生长因子等。还有研究也证实黄芪甲苷干预能下调 IL6、MMP9 表达水平，抑制炎症反应及抗氧化反应[13-14]。
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本研究对 10 个关键靶点进行了 GO 和 KEGG 富集分析，结果表明黄芪甲苷能调控多种信号通路，通过酶结合、蛋白磷酸酶结合、转录因子结合、 RNA 聚合酶所有序列特异性 DNA 结合、泛素蛋白连接酶结合等分子功能，调控基因表达、蛋白磷酸化、细胞增殖及迁移等生物过程。PI3K/Akt 信号通路是重要的胰岛素下游信号转导途径，AKT1 磷酸化后可从细胞膜上脱离，并进入细胞质中，调控 GSK-3B、p70S6K、eNOS 等的表达[15]。研究表明，PI3K/ AKT/eNOS 信号通路参与调控血管内皮生长因子 （VEGF）、血管内皮生长因子受体（VEGFR）表达，组织损伤后相关基因的表达及蛋白磷酸化水平显著升高；黄芪甲苷干预可以进一步上调 PI3K/AKT/ eNOS 通路及 VEGF、VEGFR2 蛋白表达，促进内皮细胞的增殖和迁移，加速血管生成及组织愈合[16]。高血糖状态可导致大量晚期糖基化终末产物（AGEs） 生成，AGEs 与晚期糖基化终末产物受体（RAGE）结合后，引发氧化应激反应、激活 NF-κB，并进一步导致 RAGE 表达增强，引起细胞损伤和功能紊乱，是糖尿病性创面血管新生障碍的重要机制之一[17]。文献也表明，黄芪甲苷可以降低糖尿病肾病患者的血清及肾组织中 AGEs 水平，发挥抗氧化作用，从而延缓疾病进展[18]。
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综上所述，黄芪甲苷与 AKT1、GSK-3B、HIF1A、 MMP9 等靶点及 PI3K/AKT、AGE-RAGE 等信号通路有较强关联。黄芪甲苷与靶点结合后，进一步调节下游信号通路，促进血管内皮细胞增殖、迁移，减少氧化应激和炎症反应，从而促进新生血管生成，但具体机制仍有待进一步的基础实验验证。
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摘要
目的：利用网络药理学和分子对接探讨黄芪甲苷促进血管生成的作用机制。方法：通过 SwissTarget Prediction 和 GeneCards 数据库筛选黄芪甲苷的相关靶点，通过 GeneCards 数据库筛选血管生成的相关靶点，将交集基因通过 Venny 分析，得到黄芪促血管生成的关键靶点。运用 String 数据库构建交集基因的 PPI 网络，数据导入 Cytoscape3.10.1 软件构建 PPI 网络，筛选关键基因。借助 DAVID 数据库及微生信对靶点基因进行 GO 富集分析。采用 AutoDock vina 软件进行分子对接，通过 Pymol 软件进行受体和配体可视化处理。结果：从黄芪甲苷中筛选出 93 个靶点，与血管生成有关的 803 个靶点，PPI 网络筛选出关键靶点 10 个，包括 IL6、AKT1、MMP9、STAT3、TGFB1、CTNNB1、HIF1A、BCL2、GSK3B、IL1B，富集分析提示上述靶点参与多条血管生成相关的信号通路。分子对接表明黄芪甲苷与上述靶点的结合性能良好，与 AKT1、GSK3B、HIF1A、MMP9 靶点的对接能量均小于-8 kcal/mol，以氢键结合。结论：黄芪甲苷可通过与多个靶点结合从而调节相关的信号通路，发挥促进血管生成的作用。
Abstract
Objective To investigate the mechanism of astragaloside promoting angiogenesis using network pharmacology and molecular docking. Methods The targets associated with astragaloside were identified using the SwissTarget Prediction and GeneCards databases. Targets related to angiogenesis were screened using the GeneCards database. The key targets of astragaloside in promoting angiogenesis were determined through Venn diagram analysis of the intersection genes. The Protein-Protein Interaction (PPI) network of the intersected genes was constructed using the String database. The data was imported into Cytoscape 3.10.1 software to construct the PPI network and identify key genes. Gene Ontology (GO) enrichment analysis of target genes was performed using the DAVID database and Weisheng. AutoDock vina software was used for molecular docking, and Pymol software was used for visualization of receptors and ligands. Results 93 targets were identified for astragaloside, while 803 targets were related to angiogenesis. 10 key targets were selected from the PPI network, including IL6, AKT1, MMP9, STAT3, TGFB1, CTNNB1, HIF1A, BCL2, GSK3B and IL1B. Enrichment analysis revealed the involvement of these targets in various signaling pathways, demonstrating the strong binding affinity between astragaloside and the aforementioned targets. Molecular docking showed astragaloside had good binding performance with the above targets, and the docking energy with AKT1, GSK3B, HIF1A and MMP9 was less than-8 kcal/mol, and it was bonded by hydrogen bond. Conclusion Astragaloside exhibits a potential role in promoting blood vessel formation by binding to multiple targets and regulating associated signaling pathways.
Keywords
Astragaloside ； angiogenesis ； network pharmacology ； molecular docking
