反流性食管炎（refluxesophagitis，RE）是由于胃或十二指肠的内容物反流入食管，而引起食管组织黏膜炎症、糜烂及纤维化等病变。中医学中可归属于“吐酸”“嘈杂”“反胃”“痞满”“噎膈”等范畴。目前多认为 RE 发病与脾、肝、胆、肺密切相关，其致病因素可分为内伤及外邪，内伤主要包括脾胃虚弱、先天不足、久病体虚等，外邪主要包括饮食不节、情志不畅、外感邪气。本病基本病机为胃气上逆而不降。最新胃食管反流病（GERD）中医诊疗专家共识意见将其分为 6 个证型，其中瘀血阻络证是临床常见证型之一^[1]。活血通降方则充分体现了活血通降法，活血通降方具有活血通降和胃、疏肝解瘀生肌的作用，是临床实践总结的治疗瘀血阻络型 RE 的有效方剂^[2]。

活血通降方由 7 味中药调和制作而成，由白及、丹参、郁金、枳壳、旋覆花、香附、半夏组成。白及作为君药，其苦、甘、涩，微寒，具有收敛止血、消肿生肌的功效。丹参作为臣药，味苦性微寒，有祛瘀、生新、活血的作用。郁金、枳壳、旋覆花、香附、半夏共为佐使药物：郁金味辛、苦，寒，具有活血止痛，行气解郁，清心凉血的作用；枳壳味苦、辛、酸，微寒，具有理气宽中，行滞消胀之功效；旋覆花味苦、辛、咸，性微温，具有降气，消痰，行水，止呕的作用；香附味辛、微苦、微甘，平，具有疏肝解郁，理气宽中的作用；半夏味辛，性温，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结的功效。以 7 味药物配伍，活血通降和胃、疏肝解瘀生肌，起到生肌而修复黏膜的作用。临床研究表明，活血通降方对 RE 有较好治疗效果，可缓解瘀血阻络证 RE 患者临床症状及情志，缩短胃排空时间，改善胃镜下黏膜表现^[3]，具有黏膜保护、动力调节的作用，但其具体作用机制尚仍有待进一步研究。而本文通过网络药理学的方法，深入挖掘活血通降方治疗 RE 的潜在作用靶点及治疗机制，最后对关键药效成分和靶点进行分子对接验证。

1 资料与方法

1.1 活血通降方活性成分筛选及靶点收集

在中药系统药理学数据库与分析平台检索（TCMSP http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），得到活血通降方中白及、半夏、郁金、枳壳、旋覆花、香附、半夏等药物的活性成分，设置口服生物利用度（OB）≥ 30%及类药性指数 （DL）≥ 0.18 作为筛选条件，从而挖掘各药味活性成分。之后在 TCMSP 中找到活性成分相对应的靶点蛋白信息；去重合并药物靶点信息，上传 Unipot 数据库（https://www. uniprot.org/）进行蛋白名称标准化，筛选物种为 “homo sapiens”，已验证的“reviewed”靶点，得到规范的 official gene symbol 即活血通降方潜在作用靶点。

1.2 活血通降方与 RE 共同靶点筛选

以“reflux esophagitis”为检索词，在 GeneCards 数据库（https: //www.Genecards.org/）中检索，收集到 RE 的疾病靶点，利用 Venny2.1 软件取活血通降方药物靶点与 RE 疾病靶点交集，作为活血通降方治疗 RE 的潜在作用靶点。

1.3 活血通降方治疗 RE 的蛋白质相互作用（PPI） 网络构建

将活血通降方与 RE 共同靶点上传至 STRING 数据库（https://string-db.org/）中，将蛋白质最低相互作用阈值设定为“highest confidence≥ 0.9”，去掉网络中的单一节点，获得蛋白质相互作用关系。将上述参数导入 Cytoscape3.8.2 软件，绘制 PPI 网络图，再对其网络结构进行拓扑分析，设定介数中心性（betweenness centrality，BC）、紧密度（closeness centrality，CC）及节点连接度（degree）为条件选出核心靶点。

1.4 GO 分析及 KEGG 通路富集分析

通过上传至 David 6.8 数据库（https://david.ncifcrf.go/），进行基因本体（GO）分析和通路富集分析（KEGG），从而研究活血通降方与 RE 的共同靶点。以P<0.01 筛选排名前 10 位的显著富集的 GO 功能和排名前 20 位的 KEGG 通路。

1.5 “活性成分-靶点-通路”的网络构建及拓扑分析

对“药物活性成分-潜在作用靶点-通路”进行网络构建，并进行拓扑分析，设定 BC、CC、degree 条件，筛选分析其中核心化学成分。

1.6 分子对接

在 PDB 数据库中查找核心靶点蛋白结构，并下载，再通过 PyMol1.8 去掉水分子，分离原配体，再利用 Autodock Tools 1.5.6 软件及 Autodock-vina1.1.2 软件进行分子对接， PyMol 软件实现可视化，最终得到对接相互作用模式图。

2 结果

2.1 活血通降方活性成分筛选及靶点收集

在 TCMSP 数据库中查找，设置 OB≥ 30%，DL≥ 0.18 的筛选条件，去除无对应靶点的成分，共筛选出 119 个活性成分，如喷螺醇、丹参醛、β-谷固醇等，并获得相应靶点 268 个，同时将得到的药物活性成分和靶点信息导入 Cytoscape3.8.2 软件，构建“药物活性成分-靶点”网络，见图1。

2.2 活血通降方与 RE 的共同靶点筛选

以“reflux esophagitis”为检索条件，在 GeneCards 数据库（https: //www.Genecards.org/）中检索，利用 Venny2.1 软件共获得 89 个共同靶点。

2.3 活血通降方治疗 RE 的 PPI 网络构建

构建的 PPI 网络共有 83 个节点，427 条边，详见图2。如图所见，节点直径越宽，颜色越重，则其连接度 （degree）就会越强，表明这部分蛋白位于网络中心部位。设置 BC>0.005 014，CC>0.450 867，degree>16，最终筛除 17 个核心靶点，即 STAT3、AKT1、TNF 等，详见表1。提示上述核心靶点可能在活血通降方治疗 RE 中至关重要。

2.4 GO 分析及 KEGG 通路富集分析

GO 分析结果表明，活血通降方作用的 89 个潜在靶点能够调控 571 个生物过程（biological process，BP），主要包括对 RNA 聚合酶 II 启动子的转录进行正向调节（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、对凋亡过程的负向调节（negative regulation of apoptotic process）、对药物的反应（response to drug）、细胞增殖的正向调节（positive regulation of cell proliferation）、凋亡过程（apoptotic process）、信号转导（signal transduction）等；53 个细胞组成（cellular component，CC），涉及细胞核（nucleus）、细胞质（cytoplasm）、核质体（nucleoplasm）、线粒体（mitochondrion）等；87 个分子功能（molecular function，MF），包括蛋白结合（protein binding）、酶结合（enzyme binding）、转录因子结合（transcription factor binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、细胞因子活性（cytokine activity）等。当P<0.01，分别取排名前 10 的条目进行可视化分析，见图3。

KEGG 通路富集分析结果表明，活血通降方潜在作用靶点共参与 106 条通路的调控，当P<0.01，取排名前 20 的通路进行可视化，见图4。主要包括癌症通路（pathways in cancer）、HIF-1 信号传导途径（HIF-1 signaling pathway）、TNF 信号传导途径（TNF signaling pathway）、p53 信号传导途径（p53 signaling pathway）、PI3K-Akt 信号传导途径（PI3K-Akt signaling pathway）、Toll 样受体信号传导途径（Tolllike receptor signaling pathway）等。

2.5 “活性成分-靶点-通路”网络构建及拓扑分析结果

对“药物活性成分-潜在作用靶点-通路”进行网络构建，并进行拓扑分析，以 BC、CC、degree 分析得到其中核心化学成分。结果，得到一个包含 212 个节点，835 条边的网络，见图5。利用 Network Analyzer 对其进行分析，设置 BC、CC、degree 筛选条件如前，得到网络中 20 个核心化学成分，见表2。去掉活性成分与药物之间的连线，槲皮素连接潜在靶点 67 个、木犀草苷连接潜在靶点 36 个、山奈酚连接潜在靶点 22 个、黄芩素连接潜在靶点 18 个、柚皮素连接潜在靶点 14 个。这些 degree 值较高的活性成分可能为活血通降方治疗 RE 的核心成分。

2.6 分子对接

本研究选择经典的炎症因子白细胞介素（IL）-6 做了分子对接。结果发现，最低结合能≤-5.0 kJ/mol 时，则靶点蛋白和有效药物成分结合情况越好，当结合能的值越小，那么靶点蛋白和有效药物成分结合情况越好。本研究发现，黄芩苷元、柚皮素、川陈皮素等有效药物成分均满足上述情况，所以靶点蛋白和上述药物成分具有很好的紧密结合情况。对接模式图见图6。

3 讨论

本研究以网络药理学为途径，利用“药味-靶点-通路”网络构架，从多途径、多靶点、多层次的调节作用来研究活血通降方对 RE 的治疗作用靶点及其机制。本方药含有 20 个核心组成成分及 17 个核心作用靶点。其中主要包括有槲皮素、木犀草苷等有核心组成成分，同时找到了包括 STAT3、IL-6、TNF、MAPK3、MAPK14 等 17 个与癌症、炎症发生相关联的核心作用靶点。本研究通过分子对接技术验证了 IL-6 靶点与活性成分对接，结果显示，黄芩苷元、柚皮素、川陈皮素的对接结合能均≤-5.0 kJ/mol，成分与靶点间有较好的亲和能力，表明活血通降方药味间可能通过抑制 IL-6 表达抑制炎症反应，从而起到治疗 RE 的临床效果^[4]。

JAK-STAT3 通路是 IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α等多种细胞因子的下游信号通路，在多种炎症相关性疾病中发现该通路也持续高度活化^[5]，且与炎性疾病的发生、发展密切相关^[6]。IL-6 在炎症发生发展过程中起到促进作用，是炎癌转化发生的重要因子。IL-6 可通过与其受体结合，活化 STAT3 信号通路，激活一系列下游蛋白表达，从而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖 ^[7]。在正常细胞的胞浆中， STAT3 始终处于“睡眠”模式，通过 Toll 样受体、IL6 受体等通路可以将其激活，通过 JAK/STAT3 通路促进靶基因转录，也可以作为 MAPK 的底物传递 Ras-MAPK 通路的信号在胃癌中，持续性的 STAT3 激活不仅会使基因转录失调，造成癌基因及癌相关基因表达，从而促进细胞增殖、血管生成和肿瘤转移，而且还影响细胞凋亡和抗肿瘤免疫应答^[8]。本研究发现活血通降发可以作用于 STAT3 及 IL-6 等靶点，起到抗炎、抑癌作用。

MAPK 是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，正常状态下并无活性，当细胞外刺激出现时可以将其激活。在细胞增殖、凋亡及恶化等过程中，MAPK 亦有着至关重要的调节作用^[9]。细胞外刺激如酸或胆汁等反流物刺激食管黏膜时，该靶点信号通路被快速激活，释放细胞炎症因子，在 RE 发病早期，MAPK 通路就已经被激活，同时研究也发现，当 MAPK 通路被抑制后，RE 黏膜炎症的表达大大下降^[10]。本研究发现活血通降方可作用于 MAPK3、MAPK14 等靶点，改善反流性食管炎的炎症反应，抑制炎症因子的分泌，到达治疗目的。

TP53 作为重要的抑癌因子，TP53 与食管癌的关系被广泛报道，其下游蛋白 p53 与 RE 的发病关系极为密切^[11]：p53 往往与食管黏膜暴露、细胞增生加速相关，而过度的酸碱刺激会进一步上调 p53 的表达，因此，抑制 TP53 可有效阻遏下游蛋白的表达，起到缓解细胞增生的作用^[12]。本研究发现，活血通降方可以通过作用在该靶点，起到抑制细胞增殖作用，从而有效地抑制炎癌转化，预防食管癌发生。

IL-6 由单核细胞产生，是白细胞介素的细胞因子之一，通过活化中性粒细胞并刺激活性氧族的生成，从而引起食管平滑肌张力的改变，导致 RE 的发生及炎症的加重。TNF-α也是由单核巨噬细胞分泌的一种重要的炎症细胞因子，可以增强炎症反应，促进中性粒细胞活化吞噬，产生活性氧族，诱导 RE 的发生^[13]。本研究发现活血通降方可作用于 IL-6 及 TNF-α靶点，起到抗炎作用，从而促进反流性食管炎的恢复。

PI3K/Akt 与食管组织上皮细胞增殖和凋亡关系密切，食管上皮增殖过度而凋亡不足时，则可能导致食管癌发生^[14]。VEGF 是 PI3K/Akt 信号通路激活的膜受体，在食管癌、结肠癌等肿瘤细胞中过度表达^[15]。抑制 PI3K/Akt 通路激活，可有效抑制食管腺癌细胞的增殖分化^[16]。PI3K-Akt 通路活化增强了 NF-κB的转录水平，从而激活 NF-κB下游炎症因子的释放，导致 RE 的发生。NF-κB在许多疾病的发生发展过程中有着重要作用，其对许多炎症因子的表达具有调控作用。在正常情况下，NF-κB以二聚体的形式与抑制因子 I-κB结合，形成“休眠”状态的复合体^[17]。而 RE 患者反流物中的酸、胆汁样物等^[18]刺激作用，导致休眠状态的复合体被解离活化，从而导致 NF-κB被激活，调控炎症基因的表达。另外报道，食管腺癌的发生与 NF-κB信号通路的激活关系密切^[19]，可能是 NF-κB通过调控 TNF-α表达，促进炎症因子的释放，导致炎症反应发生。此外，NF-κB还可以调控 COX-2 基因的转录和表达，这也成为炎癌转化的一个可能途径^[20]。

活血通降方通过 7 味药间不同活性成分的配伍作用，可能从以下途径起到 RE 黏膜修复作用：作用于 STAT3 通路，起到抗炎抑癌作用；降低 EGFR/ PI3K/Akt 信号通路表达，促进细胞自噬与细胞凋亡，抑制 TNF-α及 IL-6 的表达，起到抑炎作用；调控 TP53 表达，调节细胞周期，促进细胞凋亡发生，从而可以有效地预防食管癌的发生。本文利用网络药理学、分子对接技术进行数据分析筛选，准确详细地阐明了活血通降方抑制 RE 发生的机制，为其临床使用提供了理论参考。

参考文献