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结肠炎相关性结直肠癌（colitis-associated colorectal cancer，CAC）主要由结肠炎症发展而来，炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）增加了结肠癌（colorectal cancer，CRC）的患病风险，严重威胁人类健康。肠黏膜的慢性炎症能够募集免疫细胞浸润，产生促炎因子和氧化物，从而加重炎症并促进上皮细胞增殖，并诱导免疫抑制加速癌症进展。当肠道屏障受损时，树突细胞和巨噬细胞产生的炎性细胞因子促进炎症反应，持续的炎症还可诱导 DNA 损伤，导致促癌基因的激活[1]。鸦胆子是清热解毒类中药，鸦胆子的化学成分有喹啉类、生物碱类、三萜类，鸦胆子苦醇和鸦胆子苦素 D 是其主要活性成分，在炎症、肿瘤、病毒等方面发挥药理作用，抗肿瘤途径包括抑制上皮-间充质转化、抗氧化反应、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，阻止肿瘤增殖和迁移[2]。鸦胆子油乳注射液（brucea javanica oil emulsion injection，BJOEI）是中药鸦胆子的提取物，因其含有的不饱和脂肪酸如油酸和亚油酸，对肿瘤细胞膜具有亲和性，网络药理学的筛选结果显示，BJOEI 抗肿瘤通路与凋亡密切相关，实验验证其诱导细胞周期 S 期阻滞，通过调节 Bax、Bcl2、caspase3 蛋白及相关基因生物表达促进肿瘤细胞凋亡，是阻止肿瘤生长的有效途径[3]。BJOEI 联合化疗药物能改善结肠癌患者的免疫功能，抑制肿瘤新生血管的形成[4]。而阿司匹林具有一定的癌症防治作用，可以降低 CRC 的长期发病率和死亡率[5]。长期随访表明，阿司匹林能降低林奇综合征患者患 CRC 的风险[6]。阿司匹林对肠黏膜具有保护作用，能够降低前列腺素和血栓素的产生，改善巨噬细胞和 T 细胞功能，调节免疫反应，限制炎症介导的肿瘤进展，具有一定的抗肿瘤作用[7-8]。因此，本实验建立氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）和葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的小鼠 CAC 模型，观察 BJOEI 对白细胞介素 （IL）-6 因子、Ki67、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB） 及相关蛋白表达的影响，旨在揭示其抗 CAC 的作用机制。
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1 材料与方法
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1.1 实验动物
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SPF 级 C57BL/6 雄性小鼠 60 只，8周龄，体质量（20±2）g，购自北京华阜康生物科技公司，实验动物生产许可证批号：SCXK（京）2019-0008。饲养于山西省中医药研究院中心实验室。
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1.2 主要试剂与仪器
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BJOEI（江苏九旭药业有限公司，批号 Z19993152），AOM（MP 生物医学公司，批号 YC0705），DSS（上海西宝生物科技股份有限公司，批号 OU2702A），阿司匹林肠溶片（国药集团药业股份有限公司，批号 J20171021），小鼠 IL-6 高敏 ELISA 试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司，货号 EK206HS-02），p-NF-κB（Ser536）抗体（成都正能生物技术有限责任公司，货号 310013），NF-κB 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号 10745-1-AP）， OLYMPUSBX51 显微镜（上海富莱光学科技有限公司），Epoch 全波长酶标仪（Bio Tek），DYCZ-24DN 型双垂直电泳槽（北京六一生物科技有限公司）， FluorChem HD2 超灵敏化学发光凝胶成像系统（美国 ProteinSimple 公司）。
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1.3 造模与分组给药
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将 60 只小鼠适应性喂养 2 周，按体质量随机分为 6 组：正常组、模型组、BJOEI 低剂量组、BJOEI 中剂量组、BJOEI 高剂量组及阿司匹林组，每组 10 只。除正常组外，其余小鼠单次腹腔注射 AOM 溶液（1 mg/mL，10 mg/kg）。1 周后予以 2%DSS 水溶液自由饮用 1 周，之后正常饮水 2 周，以此为 1 个循环，进行 3 次周期循环，建立 CAC 小鼠模型[9]。正常组单次注射等体积生理盐水，造模期间正常饮水。
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从造模第 3 周开始，各组采用相应药物治疗。 BJOEI 分别用生理盐水 2 倍、4 倍和 8 倍稀释， BJOEI 低、中、高剂量组分别以 1.5 mL/kg、3.0 mL/kg、 4.5 mL/kg 的剂量腹腔注射 BJOEI；阿司匹林组给予阿司匹林灌胃（25 mg/kg，3 mg/mL）；模型组和正常组腹腔注射等体积生理盐水。各组给药频率均为 1 次/d，直至造模后 12 周实验结束。
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1.4 观察及检测指标
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1.4.1 一般情况
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每天同一时间段观察小鼠的精神、摄食和饮水情况，每隔 1 d 记录小鼠体质量，观察大便性状、便血和脱肛情况。
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1.4.2 样品处理
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小鼠禁食不禁水 12 h，阿佛丁麻醉后摘眼球取血，对小鼠腹部进行酒精消毒，纵行剖开腹腔，截取回盲部至肛门的结肠，沿长轴剪开肠管，用生理盐水冲洗，记录肿瘤数量，取 1.0 cm 左右的结肠组织，用 4%多聚甲醛固定，另一份于80℃保存。取出小鼠脾脏，用生理盐水冲洗后擦净，称重；脾脏指数=脾脏重量（mg）/小鼠体重（g）。
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1.4.3 病理学检测
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将用多聚甲醛固定的结肠组织常规包埋切片，HE 染色后，显微镜下观察小鼠的结肠组织病理变化。从炎症严重程度、炎症范围、隐窝损伤程度及病变程度进行病理损伤评分[10]。
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1.4.4 免疫组化检测小鼠结肠组织 Ki67、TNF-α和血管内皮生长因子（VEGF）表达水平
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将切片脱蜡，置于 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，浸在 3%双氧水溶液中，室温避光孵育 25 min，再次洗涤后加 3%的 BSA 封闭 30 min，加入适量一抗稀释液 4℃孵育过夜。PBS 洗涤后加 HRP 二抗室温孵育 50 min，洗涤后滴加 DAB 显色液，苏木素复染 3 min，脱水透明，中性树胶封片。显微镜下观察并拍照，用 Image J 软件分析，每张切片随机选取 5 个视野，测定阳性区域的平均光密度（AOD）值。
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1.4.5 ELISA 检测血清 IL-6 水平
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取血后室温静置 2 h，以 3000 r/min 离心 15 min，吸取血清，按照 ELISA 试剂盒说明书检测血清 IL-6 的含量。
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1.4.6 Western blot 检测结肠组织 NF-κB 和 p-NFκB 蛋白的表达
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肠组织中加入 RIPA 强效裂解液和蛋白酶抑制剂（体积比 100:1），充分裂解研磨后，4℃条件下以 12 000 r/min 离心 15 min，分离上清，调整每个样本蛋白浓度至 3 μg/μL，加入上样缓冲液沸水煮 5 min。上样后进行电泳并转膜，将 PVDF 膜室温封闭 1 h。分别加入适量 NF-κB（1:1000）、p-NF-κB（1:500）和β-actin（1:1000）抗体，置于密闭孵育盒中 4℃过夜，TBST 洗涤 3 次，每次 10 min，加 HRP 抗体（1:2000）室温孵育 1.5 h，再洗涤 3 次，浸在 ECL 发光液中显影成像，采用 Image J 软件测定条带灰度值。
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1.5 统计学方法
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采用统计学软件 SPSS 25.0 处理实验数据，计量资料用 表示，对于符合正态分布和方差齐性的数据，采用单因素方差分析，不符合正态分布的数据采用非参数检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 各组小鼠体质量变化
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造模期间，与正常组相比，模型小鼠出现精神萎靡、摄食量减少、腹泻、便血和脱肛情况，各治疗组小鼠的上述表现有一定程度减轻。正常组小鼠体质量始终保持上升趋势，造模小鼠体质量在 DSS 诱导的炎症急性期均有所减轻，在随后的恢复期逐渐增加，见图1。
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图1 各组小鼠体质量变化
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2.2 各组小鼠结肠肿瘤个数和脾脏指数比较
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模型组小鼠结肠有多处肿瘤形成；与模型组相比，阿司匹林组和 BJOEI 低、中、高组小鼠肿瘤个数均减少，差异有统计学意义（P<0.01）；与正常组相比，模型组小鼠的脾脏指数显著上升，差异有统计学意义（P <0.01）；与模型组相比，阿司匹林组和 BJOEI 低、中、高组小鼠的脾脏指数均下降，差异有统计学意义（P <0.01）；BJOEI 中剂量组的脾脏指数高于 BJOEI 低剂量组，差异有统计学意义（P <0.05），其余组间比较无统计学差异，见表1。
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注：a 与正常组比较，P <0.01；b 与模型组比较，P <0.05；c 与BJOEI低剂量组比较，P <0.05
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2.3 各组小鼠结肠组织病理学变化
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正常组小鼠结肠黏膜表面平坦，隐窝平行，结构完整。模型组小鼠结肠黏膜损伤严重，隐窝结构破坏，腺体减少，杯状细胞几乎消失，大量炎性细胞浸润，增生的细胞排列紊乱，细胞核大且深染，细胞核极性明显消失 （箭头所示），出现不典型增生，有黏膜内癌样改变。与模型组相比，阿司匹林组和 BJOEI 各组黏膜损伤程度较轻，可见部分正常腺体排列整齐，浸润的炎性细胞较少，黏膜局部有轻度增生。模型组的病理学评分较正常组升高，差异有统计学意义（P <0.01）； 与模型组相比，阿司匹林组、BJOEI 中、高剂量组病理学评分降低，差异有统计学意义（P <0.01），见图2。
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图2 各组小鼠结肠组织病理形态及病理学评分（HE，×400）
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2.4 各组小鼠结肠组织 Ki67、TNF-α和 VEGF 表达水平比较
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免疫组化检测结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肠组织 Ki67、TNF-α、VEGF 的 AOD 显著增加，差异有统计学意义（P <0.01）；与模型组相比，阿司匹林组的肠组织 Ki67、TNF-α、VEGF 的 AOD 值降低，差异有统计学意义（P <0.01）；与模型组相比，BJOEI 低、中、高剂量组小鼠肠组织 Ki67、 TNF-α、VEGF 的 AOD 值均降低，差异有统计学意义（P <0.01）；BJOEI 中剂量组 VEGF 的 AOD 值显著低于 BJOEI 低剂量组和高剂量组，差异有统计学意义（P <0.05），见图3 和表2。
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图3 各组小鼠结肠组织 Ki67、TNF-α 和 VEGF 表达（免疫组化，×400）
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注：a 与正常组比较，P <0.01；b 与模型组比较，P <0.01；c 与BJOEI低剂量组比较，P <0.05；d 与BJOEI高剂量组比较，P <0.05
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2.5 各组小鼠血清 IL-6 水平比较
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与正常组比较，模型组小鼠血清 IL-6 水平升高，差异有统计学意义（P <0.01），与模型组比较，BJOEI 中剂量和高剂量组小鼠血清 IL-6 水平显著下降，差异有统计学意义（P <0.05），其余组间比较差异无统计学意义，见表3。
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注：a 与正常组比较，P <0.01；b 与模型组比较，P <0.05
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2.6 各组小鼠结肠组织 p-NF-κB/NF-κB 蛋白表达水平比较
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与正常组相比，模型组小鼠结肠组织中 p-NF-κB/NF-κB 的相对表达水平显著上升，差异有统计学意义（P <0.05）；与模型组相比，阿司匹林组、BJOEI 低、中、高剂量组 p-NF-κB/NF-κB 水平均下降，差异有统计学意义（P <0.05），BJOEI 各组之间差异无统计学意义，见图4 和表4。
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图4 各组小鼠结肠组织 NF-κB 和 p-NF-κB 蛋白表达
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注：a 与正常组比较，P <0.05；b 与模型组比较，P <0.05
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3 讨论
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BJOEI 是临床应用较多的抗癌中成药注射剂，抗肿瘤作用广泛，主要用于肺癌和胃肠肿瘤的辅助治疗。BJOEI 联合化疗的疗效优于单纯化疗方案，可有效降低不良反应的发生，改善中晚期 CRC 患者的生活质量是可选择的高效低毒抗癌方案[11]。此外，BJOEI 上调促凋亡蛋白 Bax 的表达，诱导细胞凋亡，调控细胞周期，阻断 G0 期到 G1 期的转变，从而抑制食管癌细胞增殖[12]。
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Ki67 蛋白是肿瘤细胞增殖标志物，主要在细胞核表达，在结肠癌组织中的阳性率远高于正常组织，与肿瘤的侵袭和转移密切相关[13]。本研究也证实 CAC 小鼠结肠 Ki67 表达上调并呈现弥漫分布， BJOEI 干预后 Ki67 表达减弱，表明其抗癌活性可能与抑制细胞增殖有关。IL-6 是一种多效性的促炎因子，在肠炎期具有一定抗炎和修复作用，而后期促进肿瘤发展[14]。在致炎剂的诱导下，细胞因子 IL-6 和 TNF-α表达升高，NF-κB 被激活，进而诱发肿瘤，表明炎症是癌变过程的重要因素[15]。本研究表明 CAC 小鼠血清 IL-6 和肠组织 TNF-α水平明显高于正常组，提示肿瘤微环境存在炎症反应，而 BJOEI 可有效降低炎性因子的生成，减轻炎症程度。VEGF 也是 NF-κB 通路的下游蛋白之一，能够影响肿瘤的血管形成，在多种实体瘤中高表达，是具有重要价值的 CRC 诊断标志物和治疗靶点，VEGF 促进肿瘤内部和周围的血管生成，导致血管的结构和功能异常，以及血管通透性增强[16]。本研究中，模型组肠组织 VEGF 的升高表明 CAC 的血管生成增加， BJOEI 的干预则有效降低了 VEGF 的水平，具有一定的抗血管生成作用。
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结直肠癌炎症微环境中，常见的细胞因子如 IL-6、IL-1 和 TNF-α激活各自的配体增强 NF-κB 活性，NF-κB 核易位后，引发促炎因子释放到肿瘤的微环境中，还能进一步增强自身的活化，NF-κB 下游靶基因可以通过诱导促炎因子 TNF-α和 IL6，血管生成因子 VEGF 以及趋化因子的释放来加重炎性微环境[17]。NF-κB 是免疫应答的重要介质，能控制促炎细胞因子和趋化因子的表达并调节免疫细胞活化[18]。NF-κB 在慢性炎症阶段参与促肿瘤形成，是炎症与癌症之间的重要信号分子，通过对通路相关分子 VEGF、Bcl-2、BclxL、MMPs 的表达调控，进一步促进肿瘤侵袭[19]。因此，NF-κB 信号传导在癌细胞和浸润的免疫细胞之间有一定的复杂性，对结直肠癌的炎症微环境重塑具有重要作用。本研究显示，CAC 模型小鼠肠组织 NF-κB 异常激活， BJOEI 降低 p-NF-κB/NF-κB 的相对表达，抑制 NF-κB 核易位介导的炎性因子 IL-6、TNF-α、VEGF 产生，且 BJOEI 中剂量组降低明显，说明 BJOEI 抗 CRC 的机制可能与 NF-κB 通路的抑制有关。
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综上，本研究发现 BJOEI 能抑制 NF-κB 信号通路，下调炎性因子 IL-6、TNF-α、VEGF 水平，缓解结直肠的炎症反应和病理损伤，并抑制肿瘤细胞增殖，从而发挥防治 CAC 的作用。
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摘要
目的：建立结肠炎相关性结直肠癌(CAC)小鼠模型，研究鸦胆子油乳注射液(BJOEI)的抗癌作用及机制。方法：将 60 只 SPF 级 C57BL/6 雄性小鼠随机分为正常组、模型组、阿司匹林组和 BJOEI 低、中、高剂量组，每组 10 只。除空白组外，各组小鼠均采用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导 CAC 小鼠模型，从第 3 周开始，各组予以相应药物治疗，阿司匹林组 25 mg/kg 灌胃，BJOEI 低、中、高剂量组分别以 1.5 mL/kg、3.0 mL/kg、4.5 mL/kg 剂量腹腔注射 BJOEI，空白组和模型组腹腔注射等体积生理盐水，1 次/d，连续给药 10 周后取材并记录结直肠肿瘤个数，计算脾脏指数；HE 染色观察小鼠的结肠组织病理变化，并进行病理学评分；ELISA 法检测小鼠血清白细胞介素（IL）-6 水平；免疫组化检测结肠组织 Ki67、肿瘤坏死因子（TNF）-α和血管内皮生长因子（VEGF）的表达；Western blot 检测结肠组织磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）/NF-κB 蛋白相对表达量。结果：与模型组相比，BJOEI 低、中、高剂量组肠道肿瘤个数和脾脏指数均减少，有统计学意义(P<0.05)，肠组织病理学评分和 Ki67、 TNF-α、VEGF、p-NF-κB/NF-κB 表达水平均降低，有统计学意义(P <0.05)，BJOEI 中、高剂量组血清 IL-6 水平降低，有统计学意义(P <0.05)。结论：BJOEI 可能通过抑制 NF-κB 通路来减轻肠黏膜炎症反应发挥抗 CAC 作用。
Abstract
Objective To establish a mouse model of colitis-associated colorectal cancer (CAC) and study the anti-cancer effect and mechanism of brucea javanica oil emulsion injection (BJOEI) based on NF -κB pathway. Methods Sixty SPF grade C57BL/6 male mice were randomly divided into normal group, model group, aspirin group and BJOEI low, medium and high dose groups, with 10 mice in each group. Except the blank group, CAC mouse model was induced by azoomethane oxide (AOM) and dexosan sodium sulfate (DSS). Starting from the 3rd week, each group was given corresponding drug treatment, aspirin group was given 25 mg/kg intragastric administration. The low, medium and high dose groups of BJOEI were intraperitoneally injected at the doses of 1.5 mL/kg, 3.0 mL/kg and 4.5 mL/kg, respectively, and the blank group and model group were intraperitoneally injected with equal volume of normal saline once a day for 10 weeks. The number of colorectal tumors was recorded and the spleen index was calculated; HE staining was used to observe the pathological changes of colonic tissue in mice, and pathological score was performed. Serum IL-6 was detected by ELISA.The expressions of Ki67, TNF-α and VEGF were detected by immunohistochemistry. The relative expression of p-NF-κB/NF-κB protein in colon tissues was detected by Western blot. Results Compared with model group, the number of intestinal tumors and spleen index in low, medium and high dose BJOEI groups were decreased (P<0.05), and the intestinal histopathological scores and the expressionlevels of Ki67, TNF-α, VEGF, p-NF-κB/NF-κB were decreased (P <0.05). Serum IL-6 level was decreased in medium and high dose BJOEI groups (P <0.05). Conclusion BJOEI may play an anti-CAC role by inhibiting NF-κB pathway and alleviating intestinal mucosal inflammation.
