前列腺癌（prostate cancer，PCa）发生过程中肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的持续重塑是促进 PCa 生长、进展和耐药的关键^[1]。根据最新文献报道，肿瘤-基质细胞相互作用可能发挥重要作用，并强调了异质性的成纤维细胞在 PCa 恶性生长过程中的重要性^[2]。癌症相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAF）是 TME 的重要组成部分，其介导关键的致癌过程，包括血管生成、免疫抑制、转移进展和治疗耐药性，因此 CAF 是一个非常有吸引力的治疗靶点^[3-4]。然而，前列腺 CAF 如何促进 PCa 生长、进展和耐药的具体机制仍不清楚。探究这一过程的具体机制是改善 PCa 患者临床预后和发现新生物标志物的基础。本研究旨在探讨前列腺 CAF 对单核细胞及肿瘤免疫微环境影响的具体机制，寻找 PCa 治疗的新靶点，为开发新的治疗策略和药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和试剂

前列腺 CAF 和前列腺正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NF）来自临床患者组织，通过原代培养获得，单核细胞 THP1 购买自中国科学院细胞库。高糖 DMEM 细胞培养基、1640 细胞培养基、胎牛血清及 ELISA 试剂盒均购自中国索莱宝科技有限公司，罗氏反转录试剂盒、Trizol RNA 提取试剂盒购自美国罗氏公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染

前列腺 CAF 和前列腺 NF 培养于包含 10%FBS、1%双抗和 90%DMEM 的完全培养基中，单核细胞 THP1 培养于包含 10%FBS、1% 双抗和 90% RPMI-1640 的完全培养基中，置于 37℃，5%CO₂ 的细胞培养箱内。传代后，细胞长至 30%~40%，更换完全培养基，经过计算加入适量的慢病毒进行转染，6 h 后进行换液，待细胞生长至对数生长期时，加入嘌呤霉素进行筛选，进而得到转染慢病毒的细胞。

1.2.2 实时定量 PCR 实验检测细胞 mRNA 表达水平

待细胞生长至 90%时，弃去细胞培养基，加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗 3 次，加入 1 mL Trizol 溶液后，置于冰上静置 3~5 min，随后提取细胞 RNA。用罗氏反转录试剂盒进行反转录操作，得到 DNA，随后按照 PCR 试剂盒步骤进行上机操作，引物序列见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参照。

1.2.3 免疫印迹（Western Blotting）实验检测细胞蛋白表达水平

细胞生长至 80%～90%时，提取细胞总蛋白，采用 BCA 法测量蛋白浓度。蛋白上样，进行电泳、转膜、电转操作，室温牛奶封闭 1 h，一抗孵育 4℃过夜。第 2 天，二抗室温孵育 1 h，上机进行曝光操作。

1.2.4 免疫荧光实验检测组织和细胞蛋白表达水平

将前列腺 CAF 培养在爬片上，待细胞生长至 50%～70%后，去除培养基，PBS 清洗 3 次，加入 2 mL 4%细胞固定液，将细胞固定 15 min，Triton100 室温通透 20 min，37℃ BSA 封闭 1 h，一抗孵育 4℃过夜。第 2 天，用 PBS 清洗 3 次去除一抗， 37℃二抗孵育 1 h，用 PBS 清洗 3 次去除二抗， DAPI 室温染色 5 min，最后进行封片，封片后置于共聚焦显微镜下观察结果。石蜡组织切片需先脱蜡，随后进行抗原修复，敷一抗二抗，封片后进行观察。

1.2.5 免疫组化实验检测蛋白表达

第 1 天，石蜡组织切片 75℃烘烤 45 min，进行脱蜡处理，95℃抗原修复 15 min，室温过氧化氢酶阻断 10 min，一抗孵育 4℃过夜。第 2 天，清洗一抗后室温二抗孵育 1 h，DAB 显色，苏木素染色 30 s，自来水冲洗 1 min，随后进行脱水处理，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.6 ELISA 实验检测细胞分泌蛋白含量

在超净台中，对前列腺 CAF 和前列腺 NF 进行细胞传代，待细胞生长至 80%~90%后，去除培养基，无菌 PBS 清洗 3 次，加入新鲜的不含血清的 DMEM 培养基，将细胞置于 37℃，5% CO₂ 浓度的细胞培养箱中培养 24～48 h。随后收集细胞培养基，以 3000 r/min 离心 5 min，去除沉淀。然后使用 ELISA 试剂盒对前列腺 CAF 和前列腺 NF 上清液中趋化因子 C-C 基元配体 15（C-C motif chemokine ligand 15，CCL15） 含量进行测定。

1.2.7 细胞迁移实验（Transwell 实验）检测细胞迁移数目

将 200 μL 含有 1×10⁵ 个处于对数生长期的单核细胞置于 Transwell 上室内，下室分别加入 0.5 mL 敲低 CCL15 及对照组前列腺 CAF 条件培养基（CM）或含有不同浓度 CCL15 重组蛋白的培养基，将 24 孔板在 37℃，5% CO₂ 的细胞培养箱内静置 36~48 h，随后取出小室，对小室底部和下室内的细胞进行计数。

1.3 统计学方法

数据使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌微环境 CCL15 增加且主要来源于前列腺 CAF

免疫荧光结果显示，前列腺癌组织中 CCL15 明显高于正常前列腺组织。为确定 CCL15 的主要来源细胞，对 CCL15 和前列腺 CAF 标志物α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）进行前列腺癌组织连续切片的免疫组化及免疫荧光双染实验。结果显示，前列腺癌组织中的 CCL15 主要由表达α-SMA 的前列腺 CAF 表达，二者在组织中存在明显的共定位，见图1。

2.2 前列腺 CAF 分泌的 CCL15 显著高于前列腺 NF

实时定量 PCR 和 Western Blotting 检测结果显示，前列腺 CAF 中α-SMA、成纤维细胞活化蛋白 （FAP）和波形蛋白（Vimentin）的表达水平明显高于前列腺 NF，差异有统计学意义（P<0.0001），见图2A、2B。免疫荧光实验结果也显示，前列腺 CAF 中 Vimentin 的表达水平明显高于前列腺 NF。ELISA 实验发现前列腺 CAF 比 NF 分泌更高水平的 CCL15，见图2C、2D。

2.3 前列腺 CAF 来源的 CCL15 促进单核细胞迁移

Transwell 实验结果显示，敲低 CCL15 CAF 的条件培养基明显减少了 THP1 的迁移数目，降低 THP1 的迁移能力。同时，用不同浓度的 CCL15 重组蛋白进行了同样的实验，发现更高浓度的 CCL15 可以促进单核细胞 THP1 的迁移数目，提高 THP1 的迁移能力，见图3。

2.4 CCL15 与 M2 巨噬细胞联系紧密

对前列腺癌组织内 CCL15 和 M2 巨噬细胞标志物 CD68 以及 CD206 进行了多色免疫荧光染色，结果显示，CCL15 高表达的区域存在更多的 M2 巨噬细胞，CCL15 低表达的区域 M2 巨噬细胞较少，见图4。

3 讨论

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，其发生和发展与 TME 密切相关^[5-6]。TME 由肿瘤细胞、间质细胞（如成纤维细胞、免疫细胞）、血管和基质组成，对肿瘤的发展和治疗反应起重要作用^[7-8]。成纤维细胞是 TME 中的重要成分，常见的前列腺 CAF 可以通过分泌细胞因子、生长因子和化学因子等影响肿瘤的发展^[9]。其中，越来越多的研究表明，CCL15 在多种肿瘤中起着重要作用，但其在前列腺癌中的具体作用尚不清楚^[10]。

根据文献报道，CCL15 与多种癌症免疫微环境中的单核细胞浸润相关^[11-12]，但目前为止 CCL15 在前列腺癌中的作用仍然不清楚。本研究对前列腺 TME 中的 CCL15 的表达、来源以及对单核细胞迁移能力的影响进行了深入研究。首先，观察到前列腺癌组织中 CCL15 的表达明显高于正常组织，且主要来源于表达α-SMA 的 CAF，表明 CCL15 可能在前列腺癌的发生和发展中起重要作用。其次，本研究发现前列腺 CAF 分泌 CCL15 的能力显著增加。通过敲低 CCL15 的表达，发现前列腺 CAF 分泌的 CCL15 减少，单核细胞的迁移能力也随之降低，说明前列腺 CAF 通过分泌 CCL15 促进了单核细胞的迁移，可能对 TME 中免疫细胞的浸润和肿瘤细胞的迁移产生重要影响。另外，本研究还观察到 CCL15 高表达区域存在更多 M2 巨噬细胞，这种细胞类型通常与肿瘤的恶性特征相关。

综上所述，本研究揭示了前列腺 CAF 通过分泌 CCL15 促进单核细胞迁移的机制，增加了前列腺TME 中 M2 细胞的浸润。这一发现为深入理解前列腺癌的发病机制和寻找新的治疗靶点提供了重要线索，有望为前列腺癌的治疗提供新思路和策略。

参考文献