摘要
目的:研究清瘟败毒饮（QWBD）对脓毒症肾损伤大鼠的治疗作用及机制。方法:取50只健康雄性SD大鼠，根据随机数字表法分为对照组，模型组，QWBD低、中、高剂量组，生化检测大鼠血清中感染指标（白细胞计数、C反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白A等）和肝肾功能指标（血肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶）；HE观察肾组织病理学改变；免疫组化检测大鼠肾组织中髓过氧化物酶（MPO）、瓜氨酸组蛋白H3（Cit-H3）；16SrDNA测序检测肠道菌群变化情况。结果：与模型组相比，QWBD各剂量组均能一定程度降低大鼠感染指标，能一定程度改善大鼠受损的肝肾功能；大鼠肾组织HE染色结果发现，模型组大鼠肾脏组织结构严重破坏，QWBD各剂量组肾小囊扩张逐渐减少，肾小管上皮细胞水样变性逐渐减少，肾小管上皮细胞逐渐圆润、饱满；与模型组相比，QWBD各剂量组大鼠肾组织中MPO、Cit-H3蛋白的阳性率均明显降低（P＜0.01）；各组大鼠肠道菌群分析结果示，在alpha多样性上，QWBD各剂量组均能升高Chao1、Simpson、Shannon指数；在beta多样性显示，模型组与对照组对比肠道菌落存在差异，QWBD各组与模型组、对照组对比均存在差异，β多样性较高；物种组成热图分析提示QWBD干预后有益菌增多、有害菌减少，在门、纲、目、科、属各水平提示模型组有害菌明显较多，QWBD组有益菌明显较多，提示QWBD能够显著改善肠道菌群。结论：QWBD对脓毒症肾损伤大鼠的治疗作用明确，其治疗机制可能与通过调节肠道菌群，抑制中性粒细胞胞外诱捕网相关。
关键词
Abstract
Objective: To investigate the therapeutic effect and mechanism of Qingwen Baidu Yin on septic kidney injury rats. Method Fifty healthy male SD rats were randomly divided into five groups: Sham group, CLP group, QWBD low, medium, and high dose groups according to a random number table. Biochemical tests were conducted to detect infection indicators and liver and kidney function in the serum of the rats; HE observation of pathological changes in renal tissue; Immunohistochemical detection of MPO and Cit-H3 in rat kidney tissue; 16S rDNA sequencing was used to detect changes in gut microbiota. Results Compared with the CLP group, all dose groups of QWBD were able to reduce the infection index of rats to a certain extent and improve the damaged liver and kidney function of rats to a certain extent; The HE staining results of rat kidney tissue showed that the structure of the kidney tissue in the CLP group was severely damaged, and the dilation of renal small sacs gradually decreased in each dose group of QWBD. The watery degeneration of renal tubular epithelial cells gradually decreased, and the renal tubular epithelial cells gradually became round and full; Compared with CLP, the positive expression of MPO and Cit-H3 proteins in the renal tissue of rats in each dose group of QWBD was significantly reduced (P<0.01); The analysis of gut microbiota in each group of rats showed that in terms of alpha diversity, all dose groups of QWBD were able to increase Chao1, Simpson, and Shannnon indices; In the beta diversity display, there were differences in gut microbiota between the CLP group and the Sham group, as well as differences between the QWBD group and both the CLP and Sham groups. The beta diversity was relatively high; Species composition heatmap analysis suggests an increase in beneficial bacteria and a decrease in harmful bacteria after QWBD intervention. At the phylum, class, order, family, and genus levels, it suggests that the CLP group has significantly more harmful bacteria, while the QWBD group has significantly more beneficial bacteria, indicating that QWBD can significantly improve gut microbiota. Conclusion QWBD has a clear therapeutic effect on septic kidney injury rats, and its therapeutic mechanism may be related to regulating gut microbiota and inhibiting NETs.
脓毒症肾损伤显著增加患者死亡风险[1]，如何提高脓毒症肾损伤的救治率是临床实践的挑战。研究表明，中药复方及其有效成分在改善脓毒症相关肾损伤具有明显优势[2，3]，如清瘟败毒饮（Qingwen Baidu，QWBD）已广泛应用于脓毒症肾损伤的治疗[4]，但其具体作用机制尚不明确。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成在脓毒症肾损伤中起关键作用[5]，其中镶嵌有瓜氨酸组蛋白H3（citrullinated histone H3，Cit-H3）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）等蛋白[6]。其中，MPO与肠道菌群关系密切[7]。目前脓毒症肾损伤动物模型成熟，盲肠结扎穿孔术（cecal ligature and perforation，CLP）一种经济且简便的脓毒症肾损伤模型，其原理是通过结扎并穿孔盲肠，使粪便流入腹腔引发感染，从而诱导脓毒症，造模24 h后，肾损伤达到高峰[8-10]。本研究采用CLP法建立脓毒症肾损伤动物模型，明确QWBD的治疗作用，探讨QWBD通过调节肠道菌群抑制NETs形成治疗脓毒症肾损伤的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
SPF级健康雄性SD大鼠50只，6~8周龄，体质量（200±20）g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司。该实验经天津市中西医结合医院伦理委员会批准（批准号：NKYY-DWLL-2023-187）。
1.2 QWBD制备
称取生石膏50 g，生地20 g，水牛角9 g，黄连10 g，知母12 g，玄参12 g，栀子9 g，桔梗9 g，黄芩9 g，赤芍9 g，连翘9 g，丹皮9 g，淡竹叶6 g，甘草6 g，加入上述药材总质量8倍的水，即料液比（固液比）为1∶8（g/mL），煎煮30 min，浓缩成生药2 g/mL备用。
1.3 实验分组、造模和给药方法
将50只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组，模型组，QWBD低、中、高剂量组，每组10只，其中模型组，QWBD低、中、高剂量组运用CLP方法建立脓毒症肾损伤模型[8-10]，对照组只切开腹壁并缝合，不进行CLP。对照组：灌胃生理盐水2 mL；模型组：灌胃生理盐水2 mL；QWBD低剂量组：灌胃QWBD7.5 g生药/kg；QWBD中剂量组：灌胃QWBD15 g生药/kg；QWBD高剂量组：灌胃QWBD30 g生药/kg。上述5组均是每12 h灌胃1次，连续给药7 d。
1.4 观察指标及检测方法
1.4.1 血清感染指标
造模给药7 d后，自腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，收集血液，采用血细胞分析仪检测各组大鼠血清中白细胞计数（WBC）、中性粒细胞计数（Gran）；采用生化分析仪检测各组大鼠C反应蛋白（CPR）、降钙素原（PCT）、血清淀粉样蛋白A（SAA）水平。
1.4.2 肝肾功能
采用生化分析仪测定各组大鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）水平。
1.4.3 肾组织病理
末次给药后，麻醉并处死大鼠，取其肾组织，经4%多聚甲醛固定24 h后进行脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察组织病理学改变。
1.4.4 免疫组化观察大鼠肾组织中MPO、Cit-H3阳性率
各将组大鼠肾脏组织石蜡包埋后切片，制备一抗孵育液体（MPO与5% BSA以1∶400混匀，Cit-3与5% BSA以1∶300混匀）和二抗孵育液，通过采图系统Image-Pro Plus6.0采集分析图像。
1.4.5 肠道菌群16SrDNA测序
收集各组大鼠造模给药7 d后结肠中的新鲜粪便，放入无菌冻存管，进行PCR扩增，检测PCR产物扩增目的条带大小，使用lllumina Miseq PE300高通量测序平台进行双端测序，对数据进行过滤、拼接，并进行数据分析。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件分析数据，满足正态分布用均数±标准差表示，多组间比较满足正态性和方差齐性条件时，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血清感染指标比较
与对照组相比，模型组大鼠血清WBC、Gran、CRP、SAA、PCT明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，QWBD各剂量组上述感染指标均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；对于WBC、Gran、CRP、SAA，QWBD高剂量组<QWBD中剂量组<QWBD低剂量组，QWBD中剂量组的PCT水平低于QWBD低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；QWBD中、高剂量组PCT差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。
表1各组大鼠血清感染指标比较
注：a与对照组相比，P<0.01；b与模型组相比，P<0.01；c与QWBD低剂量组相比，P＜0.05；d与QWBD中剂量组相比，P＜0.05
2.2 各组大鼠肝肾功能指标比较
与对照组相比，模型组的大鼠血清Cr、BUN、ALT、AST明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，QWBD各剂量组的大鼠血清Cr、BUN、ALT、AST均降低，对于Cr，QWBD高剂量组<QWBD中剂量组<QWBD低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。对于BUN，QWBD中剂量组和高剂量组均低于QWBD低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），但中、高剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05），QWBD低、中、高剂量组间ALT、AST差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。
表2各组大鼠肝肾功能指标比较
注：a与对照组相比，P<0.01；b与模型组相比，P<0.01；c与QWBD低剂量组相比，P＜0.05；d与QWBD中剂量组相比，P＜0.05
2.3 QWBD对各组大鼠肾组织病理学形态的影响
大鼠肾组织HE染色结果发现，对照组大鼠肾脏组织皮质中肾小球细胞数量及基质均匀，肾小管上皮细胞圆润、饱满，肾间质无明显增生，未见明显的炎性细胞浸润。模型组大鼠肾脏组织结构严重破坏，皮质中多见肾小囊扩张，间隙增宽，肾小球毛细血管排列不规则，肾小管上皮细胞水样变性，细胞肿胀，胞质疏松、淡染，较多肾小管扩张，管腔形状不规则，肾小管上皮细胞扁平化，并可见少量肾小管内含有嗜酸性物与脱落的上皮细胞，病理评分为（5.67±0.52）分，较对照组的0分明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，QWBD低剂量组少见肾小囊扩张，间隙增宽，较多肾小管上皮细胞水样变性，细胞肿胀，胞质疏松、淡染，并可见少量肾小管内含有嗜酸性物与脱落的上皮细胞，病理评分为（1.67±0.52）分。QWBD中剂量组少量的肾小囊扩张，少量的肾小管上皮细胞水样变性，细胞肿胀，胞质疏松、淡染，并可见少量肾小管内含有嗜酸性物与脱落上皮细胞，病理评分为（1.17±0.41）分。QWBD高剂量组肾脏组织皮质中肾小球分布均匀，少见肾小囊扩张，间隙增宽，肾小管上皮细胞圆润、饱满，病理评分为0分。QWBD低、中、高剂量组两两对比，组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。
图1各组大鼠肾组织病理形态学观察（HE染色，×200）
2.4 QWBD对各组大鼠肾组织中MPO、Cit-H3的影响
与对照组相比，模型组的大鼠肾组织中MPO、Cit-H3蛋白的阳性率增加（P＜0.01）。与模型组相比，QWBD各剂量组大鼠肾组织中MPO、Cit-H3蛋白的阳性率均降低，且QWBD高剂量组＜QWBD中剂量组＜QWBD低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、3，表3。
图2各组大鼠肾组织中MPO的表达（×200）
图3各组大鼠肾组织中Cit-H3的表达（×200）
表3QWBD对大鼠肾组织中MPO、Cit-H3蛋白阳性表达的影响
注：a与对照组相比，P<0.01；b与模型组相比，P<0.01；c与QWBD低剂量组相比，P＜0.05；d与QWBD中剂量组相比，P＜0.05
2.5 QWBD对各组大鼠肠道菌群的影响
2.5.1 alpha多样性分析
与对照组相比，模型组大鼠的Chao1、Simpson、Shannon指数显著减少（P＜0.01），说明模型组菌群丰度及多样性明显降低。与模型组相比，QWBD各剂量组Chao1、Simpson、Shannnon指数均升高，但QWBD低、中、高剂量组间差异无统计学意义（P>0.05），见表4。
表4QWBD对大鼠肠道菌群alpha多样性的影响
注：a与对照组相比，P<0.01；b与模型组相比，P<0.01
2.5.2 beta多样性分析
基于Bray-crutis距离，采用主坐标分析（PCoA），对不同分组间的肠道菌群差异进行展示，对照组和模型组重叠区域小且明显分离，提示这两组群落的物种组成相似度较低，β多样性较高，QWBD各组分布相对独立，透明多边形的重叠区域小，说明与对照组、模型组的物种组成差异显著，β多样性较高，提示模型组与对照组对比肠道菌落存在差异，QWBD各组与模型组、对照组对比均存在差异，β多样性较高（图4）。
2.5.3 物种组成热图分析
基于肠道菌群属水平的相对丰度数据，绘制了热图以展示各组中菌群的分布情况。热图的行代表菌属，列代表分组，颜色梯度表示菌属的相对丰度（从低到高）。从热图中可以看出，与对照组比较，模型组梭状芽孢杆菌、韦荣球菌、变形杆菌、霍尔德曼氏菌、摩根氏菌、聚集杆菌、放线菌、志贺氏菌等显著升高，乳酸杆菌、双歧杆菌、苏黎世杆菌、普雷沃菌、念珠菌显著降低；与模型组比较，QWBD各组可以降低梭状芽孢杆菌、韦荣球菌、变形杆菌、霍德尔曼氏菌、摩根氏菌、聚集杆菌水平，升高乳酸杆菌、双歧杆菌、苏黎世杆菌、普雷沃菌、念珠菌水平，提示QWBD干预后有益菌增多、有害菌减少，QWBD可以有效改善被破坏的肠道菌群，有助于肠道菌群的恢复（图5）。
图4beta多样性
图5物种组成热图
2.5.4 差异菌属的筛选
为进一步筛选各组间的差异肠道菌群，采用线性判别分析（LEfSe）筛选不同组间的差异肠道菌群，即生物标志物。基于线性回归分析（LDA）阈值大于4的情况下，五组共筛选出40种差异肠道菌群，在门水平上，与对照组比较，模型组疣微菌门增多，厚壁菌、拟杆菌减少，与模型组比较，QWBD组放线菌增多；在纲水平上，与对照组比较，模型组疣微菌增多，拟杆菌减少，与模型组比较，QWBD组芽孢杆菌、放线菌增多；在目水平上，与对照组比较，模型组疣微菌、巴斯德氏菌增多，拟杆菌减少，与模型组比较，QWBD组芽孢杆菌、放线菌乳杆菌、肠杆菌、伯克氏菌增多；在科水平上，与对照组比较，模型组巴斯德氏菌增多，瘤胃球菌菌减少，与模型组比较，QWBD组乳杆菌、双歧杆菌、普雷沃氏菌增多；在属水平上，与模型组比较，QWBD组双歧杆菌、普雷沃氏菌增多。结合筛选出的肠道菌群，在门、纲、目、科、属各水平提示模型组有害菌明显较多，QWBD组有益菌明显较多，提示QWBD能够显著改善肠道菌群（图6）。
图6各组LEFSe分析
3 讨论
清瘟败毒饮具有清热解毒、凉血泻火的功效，能改善脓毒症肾损伤患者中医症候评分和临床有效率[11]，对脓毒症肺损伤及脓毒症引起的凝血功能障碍有效，且其作用机制可能与调节细胞中FTH、FTL、Transferrin和GPX4铁死亡相关因子水平相关[12]，QWBD可以有效的改善脓毒症大鼠的凝血功能障碍[13]。本研究结果显示，QWBD能降低感染指标，降低血肌酐和尿素氮水平，使肾小囊扩张逐渐减少，肾小管上皮细胞水样变性逐渐减少。故本研究结果证实，QWBD可以有效治疗脓毒症肾损伤大鼠的感染，改善受损的肾功能，改善肾组织病理学损伤，有效治疗脓毒症肾损伤。
肠道菌群分为有益菌、中性菌、有害菌，比如厚壁菌门中大多数成员为肠道潜在有益菌，拟杆菌门中的多数成员具有抗炎作用，而肠道潜在有害菌大多属于变形菌门[14-15]。本研究中模型组大鼠血肌酐明显升高、肾功能明显受损，梭状芽孢杆菌、韦荣球菌、变形杆菌等肠道有害菌显著升高，乳酸杆菌、双歧杆菌、苏黎世杆菌等肠道有益菌显著降低，说明随着脓毒症肾损伤的出现，肠道菌群发生变化。QWBD干预后，肠道菌群结果提示乳酸杆菌、双歧杆菌、放线菌等有益菌增多，梭状芽孢杆菌、韦荣球菌、变形杆菌等有害菌减少，同时QWBD各组大鼠的肾功能较模型组明显改善，说明QWBD干预后肠道菌群有所改善，提示QWBD可以改善肠道菌群，同时说明随着肠道菌群的有害菌减少、有益菌增多，肾功能有所好转，提示QWBD可有效改善肠道菌群，且脓毒症肾损伤与肠道菌群密切相关。另外一方面，感染与肠道菌群同样密切相关，本研究中模型组感染指标明显升高，肠道菌群发生变化，出现有害菌增多、有益菌减少，QWBD各组感染指标较模型组下降，肠道菌群方面变为有益菌增多、有害菌减少，故说明感染与肠道菌群的情况也密切相关，QWBD在治疗感染的同时，可以显著改善感染所致的肠道菌群失调。综上可见，QWBD调节肠道菌群疗效确切，且与肾损伤、感染关系密切。QWBD调节肠道菌群的疗效可能通过多靶点、多途径协同实现，QWBD的药物组成黄连、黄芩、栀子等均有调节肠道菌群的作用[16-17]。有研究证实QWBD有效治疗感染，肠道微生物组与脓毒症的发生和发展密切相关[18]，QWBD可能同时通过控制感染以达到调节肠道菌群的作用。文献研究表明，肠道菌群与脓毒症肾损伤关系密切，肠道微生物群中罗斯氏菌属和葡萄球菌属与血清肌酐升高呈正相关[19]，而普雷沃氏菌和粪球菌则呈负相关，且补充益生菌可以减轻急性肾损伤、延缓急性肾损伤的进展[20]，本课题组前期研究表明凉血活血方通过改善肠道菌群失调，对脓毒症所致AKI有明显的保护作用[3]。结合以上文献研究，故可推测，QWBD可能是通过调节肠道菌群从而改善了脓毒症肾损伤。本研究存在一定的局限性，只是通过实验结果及文献研究进行推断得出QWBD通过调节肠道菌群改善了肾损伤，没有进行体外实验，未来可进一步加做体外实验进一步证实QWBD改善脓毒症肾损伤的有效性及作用制剂，也是未来进一步研究的方向。
NETs的形成在脓毒症肾损伤中起关键作用，急性肾小管坏死患者肾组织高表达NETs组分[21]，且NETs参与了脓毒症引起的AKI发病进程[22]。本研究显示，脓毒症肾损伤组的大鼠肾组织中MPO、Cit-H3蛋白的阳性表达显著增加，NETs明显增多，QWBD各剂量组大鼠肾组织中MPO、Cit-H3蛋白阳性表达均明显降低，说明在脓毒症肾损伤时NETs的表达升高，QWBD抑制了NETs的表达从而改善了脓毒症肾损伤。MPO是NETs中的组成之一。有研究显示，人参茎叶总皂苷通过改善小鼠肠道菌群紊乱抑制肺组织中MPO水平，溃结改良方可能通过调节肠道菌群，降低MPO治疗UC，肠道微生物通过调控NETs的形成参与心脏缺血再灌注损伤，以上提示肠道菌群与NETs关系密切，由此推测，可以通过调节肠道菌群抑制NETs的重要组成之MPO活性，以抑制NETs形成[23-25]。结合上述结论，QWBD通过调节肠道菌群改善了脓毒症肾损伤，且QWBD通过抑制NETs的表达改善了脓毒症肾损伤，结合文献可以推测，QWBD的治疗作用可能是通过调节肠道菌群以抑制NETs而发挥作用，而QWBD如何通过调节肠道菌群抑制了NETs尚需进一步研究。
本研究可得出QWBD对脓毒症肾损伤大鼠治疗作用明确，其治疗机制可能与调节肠道菌群和抑制NETs相关，但本研究存在一定局限性，本实验设计未包含阳性对照组，对于脓毒症肾损伤的治疗包括积极抗感染、液体复苏、甚至血液净化等，相对复杂，在动物实验中存在一定的实施困难，故本实验未设计阳性对照组，存在不足；通过现有的严谨设计可证实目前结论，在未来可进一步完善阳性对照组更好的证实本结论。
综上所述，本研究揭示了QWBD对脓毒症肾损伤大鼠疗效确切，证实通过调节肠道菌群改善了脓毒症肾损伤，且发现QWBD抑制NETs以改善脓毒症肾损伤，并提出QWBD可能是通过调节肠道菌群以抑制NETs而发挥作用，从多角度、多层次、多靶点阐明QWBD治疗脓毒症肾损伤的机制，丰富了中医“清热解毒、凉血化瘀”法治疗脓毒症肾损伤的现代科学内涵，为临床提供了更安全有效治疗脓毒症肾损伤的药物，同时为传统中医药QWBD治疗脓毒症肾损伤提供新的分子生物学基础。