摘要
目的：观察凉血活血方对脓毒症诱导小鼠急性肾损伤（AKI）的保护作用及机制。方法：15只雄性C57BL/6小鼠，采用盲肠结扎穿刺术（CLP）制备脓毒症AKI小鼠模型，小鼠随机分为三组：假手术组、模型组和凉血活血方组，每组5只。凉血活血方组给予凉血活血方（6 g/kg）连续灌胃2 d（1次/d），假手术组和模型组给予同等剂量生理盐水灌胃，术后24 h麻醉取材。HE染色观察肾组织病理变化。生化法检测小鼠肾组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）的含量，检测血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平。酶联免疫吸附法（ELISA）检测肾组织炎症因子[白细胞介素（IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）]水平。Western blotting检测肾组织铁死亡相关蛋白溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶1（HO-1）蛋白水平。结果：凉血活血方可以改善脓毒症小鼠的肾功能损害和肾组织病理损伤，降低肾组织中IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子水平和MDA含量，同时提高肾组织中SOD、GSH含量及SLC7A11、GPX4、Nrf2、HO-1蛋白水平，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：凉血活血方能够改善脓毒症所致AKI小鼠的肾组织病理损伤和肾功能，其机制可能与抑制肾组织铁死亡有关。
关键词
Abstract
Objective To observe the protective effect and mechanism of Liangxue Huoxue decoction on sepsis-induced acute kidney injury (AKI) in mice. Methods Twenty-four male C57BL/6 mice were used to establish a sepsis-induced AKI mouse model by cecal ligation and puncture (CLP), and the mice were randomly divided into three groups: sham operation group（Sham group）, model group（CLP group）, and Liangxue Huoxue decoction group（LXHX group）. The LXHX group was received intragastric administration of the Liangxue Huoxue decoction (6 g/kg) once daily for 2 consecutive days. The Sham and CLP group were given the same dose of normal saline by gavage. Samples were collected under anesthesia 24 hours after the operation. The pathological changes of renal tissue were observed by HE staining. The contents of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) in mouse renal tissues were detected by biochemical methods. Renal function was assessed by measuring serum creatinine (Cr) and blood urea nitrogen (BUN) levels. The levels of inflammatory cytokines in renal tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Protein expression levels of ferroptosis-related markers (SLC7A11, GPX4), Nrf2, and HO-1 in renal tissue were analyzed by Western blotting. Results The Liangxue Huoxue decoction can improve renal function impairment and renal tissue pathological damage in septic mice, reduce the levels of inflammatory factors such as IL-1β, TNF-α, and IL-6 and the content of MDA in renal tissue, and simultaneously increase the content of SOD and GSH in renal tissue as well as the protein levels of SLC7A11, GPX4, Nrf2, and HO-1( P<0.05). Conclusion The Liangxue Huoxue decoction can improve the pathological damage of renal tissue and renal function in sepsis-induced AKI. The mechanism may be to exert a protective effect by inhibiting ferroptosis of renal tissue.
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是由多因素导致的、以肾小球滤过率迅速下降为特征的综合征，为临床常见的急危重症之一。其中，脓毒症是其最常见的诱发因素之一，它通过炎症、缺氧和氧化应激等机制影响肾脏，导致肾小管及肾间质损伤，最终引发AKI[1]，形成脓毒症相关急性肾损伤（sepsis associated acute kidney injury，S-AKI）。一项流行病学调查显示，在19 579例脓毒症住院患者中，有近半数（48.1%）患者发生了AKI，其死亡率更高达55％[2]。
S-AKI的发病机制复杂，铁死亡作为一种新的程序性细胞死亡方式，在AKI的病理过程中发挥重要作用。它是一种由脂质过氧化引起的铁依赖性细胞死亡方式，其主要特征是脂质过氧化[3]和铁超载[4]，可以放大炎症反应造成更多细胞死亡，最终诱发多器官功能衰竭。研究证实通过不同途径抑制铁死亡可以明显保护肾组织[5-7]。核因子红系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）是一种抗氧化转录因子，其调节许多参与对抗铁死亡的基因[8]。褪黑素作为一种抗氧剂，其可以通过上调Nrf2/人血红素氧合酶（human heme oxygenase-1，HO-1）通路抑制铁死亡和减轻S-AKI[9]。右美托咪定可以通过Kelch样ECH关联蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）-Nrf2/HO-1途径减轻脂多糖（LPS）诱导的急性肾损伤铁死亡。中药复方或单体在防治S-AKI方面展现了独特优势，通过降低氧化应激、调节自噬、抗炎作用、减轻线粒体损伤等多种机制防治AKI[10]。凉血活血方作为院内制剂在临床上多用于治疗多种炎症性疾病。有研究发现凉血活血方能够改善S-AKI小鼠肠道菌群，减轻肾组织损伤[11]，且对脓毒症引起的急性肺损伤有明显改善作用[12]。本研究观察凉血活血方对S-AKI小鼠铁死亡的调节作用，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
15只SPF级雄性C57BL/6小鼠，6~8周龄，体质量20~22 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，合格证号SCXK（京）2014-0013。饲养于SPF级动物房，环境温度20~25℃，相对湿度40%~60%，12 h明暗循环。实验期间自由饮食饮水，实验前动物适应性饲养至少1周。
1.1.2 实验药物
凉血活血方由红藤18 g，丹皮9 g，赤芍6 g，延胡索6 g组成，饮片购自安国市普天和中药饮片有限公司。参照《医学实验动物学》[13]，按人与小鼠之间的用药剂量换算，即小鼠的剂量（mg/kg）=W（动物与人体的每公斤体质量剂量折算系数）×人的剂量（mg/kg），查表得W=9.01，小鼠以20 g体质量计算，人以60 kg体质量计算。饮片加入10倍量的水，浸泡30 min，水沸后煎煮30 min，纱布粗滤取滤液；残渣加入10倍量的水再煎煮30 min，过滤；合并两次滤液，通过减压旋转蒸发仪回收溶剂，冷冻干燥，确定生药含量为0.6 kg/L，置于4℃冰箱保存备用。
1.1.3 实验试剂及仪器
白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等炎症因子ELISA试剂盒购自攸克生命科学技术（杭州）有限公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）购自南京建成生物工程研究所。溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、Nrf2和HO-1抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。酶标仪（上海科华实验室系统有限公司），垂直电泳转印系统及全自动多功能化学发光分析系统（美国伯乐公司），正置显微镜（日本Nikon公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型制备、分组及给药
将15只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组：假手术组、模型组和凉血活血方组，每组各5例。采用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）术建立S-AKI动物模型。CLP是目前最接近人类脓毒症的模型，从本世纪80年代开始应用，被认为是脓毒症的“金标准”模型，它通过驱动盲肠内容物持续释放，引起肠屏障功能障碍和炎症反应失调，从而诱发S-AKI[14]，具体方法参考文献[15]：术前进食不禁水12 h。麻醉备皮，常规消毒，下腹部正中切口，找到盲肠并在结肠根部和盲肠末端中点以4-0丝线结扎，结扎时避免损伤盲肠动脉；在盲肠末端和缝合线中间以21-G注射器针头自系膜缘横穿盲肠，撤针后挤出一小滴肠内容物，还纳盲肠，关腹。模型组和凉血活血方组均行CLP术，假手术组麻醉后仅开腹翻动盲肠。凉血活血方组给予凉血活血方（6 g/kg）连续灌胃2 d（1次/d），第2次给药后2 h开始行CLP术；模型组及假手术组给予同等体积生理盐水灌胃。术后给予食水继续饲养，24 h后麻醉取材。摘眼球取血，离心后收集血清备用；收集小鼠双侧肾组织，一部分冻存-80℃用于后续指标检测，一部分放入10%福尔马林液中固定。本研究方案经过天津市南开医院动物伦理委员会批准（审批号：NKYY-DWLL-2023-181）。
1.2.2 苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色
将小鼠肾组织固定24 h后，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片（厚度4 μm），常规HE染色，光学显微镜下观察肾组织病理学改变，并进行病理损伤评分。
1.2.3 肾功能检测
取出血清样品，使用血肌酐试剂盒、尿素氮试剂盒，按照试剂盒说明书，分别测定小鼠血清中的肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）含量，根据酶标仪中各个样品的吸光度，计算出对应的SCr和BUN含量。
1.2.4 肾组织中MDA、GSH、SOD水平检测
根据试剂盒说明书检测肾组织MDA、GSH、SOD水平。
1.2.5 ELISA法检测肾组织中炎症因子水平
制备10%肾组织匀浆，离心取上清，按说明书检测上清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。
1.2.6 蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测肾组织中SLC7A11、GPX4、Nrf2和HO-1蛋白表达水平
取-80℃保存的肾组织约40 mg，以1︰10比例加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液（RIPA），组织匀浆机匀浆，充分裂解1 h后，离心取上清即为组织蛋白液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，金属浴加热变性。取组织样品经SDS-PAGE凝胶分离蛋白，电转易至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入特异性一抗（SLC7A11、GPX4、Nrf2和HO-1）4℃过夜。20 h后洗膜，然后加入二抗，室温孵育2 h，洗膜后用增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）进行发光显色，使用凝胶成像系统显色成像。以GAPDH为内参，蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示。
1.3 统计学分析
数据应用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 凉血活血方对脓毒症AKI小鼠肾功能的影响
与假手术组相比，模型组BUN和SCr水平显著升高（P＜0.01），与模型组相比，凉血活血方组BUN和Scr水平明显降低（P＜0.05），见表1。
表1各组小鼠血清BUN、SCr水平比较
注：a与假手术组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.05
2.2 凉血活血方对脓毒症AKI小鼠肾组织病理变化的影响
假手术组小鼠肾组织基本正常，肾小球和肾小管结构清晰，大小正常。与假手术组相比，模型组小鼠肾小管损伤和扩张，肾小管上皮细胞体积增大或变性，肾小球结构紊乱，间隙变宽。经凉血活血方干预后，肾组织病理改变明显减轻。模型组肾组织损伤评分高高于假手术组，凉血活血方组评分低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。
2.3 凉血活血方对脓毒症AKI小鼠肾组织炎症反应的影响
模型组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显高于假手术组，凉血活血方组上述各炎症因子水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
2.4 凉血活血方对脓毒症AKI小鼠铁死亡的影响
与假手术组比较，模型组MDA增高，GSH、SOD的活性降低，而凉血活血方处理后，MDA的生成降低，GSH、SOD的活性提高，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。检测铁死亡抑制蛋白GPX4和SL7A11的表达结果显示，模型组的GPX4和SL7A11水平低于假手术组，凉血活血方组的GPX4和SL7A11水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05，图2）。
图1各组小鼠肾组织病理变化（×100，×400）及组织损伤评分比较
表2各组小鼠肾组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
表3各组小鼠肾组织中MDA、GSH、T-SOD 的含量
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
2.5 凉血活血方通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制铁死亡改善脓毒症AKI
模型组小鼠肾脏中Nrf2、HO-1蛋白的表达均显著低于假手术组（P＜0.01），凉血活血方组Nrf2、HO-1蛋白水平高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。
3 讨论
S-AKI作为脓毒症常见并发症，对其有效治疗是改善脓毒症的预后和降低死亡率的有效方式。随着研究的不断深入，人们逐渐发现本病机制复杂，单靶点药物难以有效的控制疾病[16]。中医药以其有效成分丰富，治疗靶点广泛的独特优势为本病的治疗提供了新的思路和方法。本研究通过CLP建立脓毒症AKI模型，观察凉血活血方是否对脓毒症诱导的AKI具有保护作用及潜在机制。本方共四味药：红藤、丹皮、赤芍和延胡索。方中红藤清热解毒兼具活血，为君药；丹皮清热凉血，活血散瘀，为臣药；赤芍凉血活血为佐药，延胡索化瘀止痛为使药。综观全方，合清热、解毒、破瘀于一体，全方配伍具有活血化瘀，清热解毒，行气止痛之功效。通过本研究发现，凉血活血方可以明显减轻CLP模型小鼠肾组织病理改变并降低病理损伤评分，且能够明显改善肾功能，降低血清肌酐和尿素氮水平。同时抑制肾组织炎症因子TNF-α、IL-1β和 IL-6的水平，能够有效地防治脓毒症AKI。
图2各组小鼠肾组织SLC7A11、GPX4蛋白表达的变化
图3各组小鼠肾组织Nrf2、HO-1蛋白表达的变化
近年来，铁死亡成为了各个领域新的研究热点。它是一种由脂质过氧化引起的铁依赖性细胞死亡模式，具有独特的形态学和生化特征。谷氨酸-胱氨酸反转运蛋白（System Xc-）、氧化还原失衡、铁和脂质代谢等多种调控途径参与铁死亡的发生。AKI发病机制复杂，多项研究表明铁死亡可能在AKI病理生理学中起到重要作用，抑制铁死亡可以有效减轻AKI的进展。氧化应激是AKI的主要病理因素，它被证实与铁死亡有密切的联系[17]。通过分析GSH、SOD及脂质过氧化产物MDA的水平，本研究证实脓毒症诱导AKI存在氧化还原失衡，给予凉血活血方能明显抑制CLP模型小鼠肾脏GSH、SOD水平的下降和MDA的升高，减轻氧化损伤。GPX4是一种重要的铁死亡抑制蛋白，利用谷胱甘肽（GSH）作为还原性辅助因子，将有毒的脂质氢过氧化物（L-OOH）转化为无毒的脂质醇（L-OH），从而限制了脂质过氧化的扩散和积累，以维持氧化还原稳态，保护细胞膜免受脂质过氧化损伤[18]。有研究发现GPX4 基因缺陷小鼠出生2周内即死于大量肾小管坏死和急性肾损伤[19]。SLC7A11是System Xc-转运体的主要活性亚基，通过参与GSH的合成调控细胞内GSH的动态平衡。为了进一步探索凉血活血方对脓毒症AKI小鼠铁死亡的作用，采用Western blotting检测肾组织GPX4、SLC7A11的蛋白水平。与假手术组比较，模型组GPX4、SLC7A11的蛋白水平明显降低，但凉血活血方可以明显增加二者的蛋白水平。这些结果表明铁死亡可以加重脓毒症引起的AKI，凉血活血方可通过抑制铁死亡减轻脓毒症AKL。
随着对铁死亡机制的深入研究，人们发现转录因子Nrf2作为一种关键的抗氧化反应调节因子，在控制氧化还原平衡中至关重要，它可以通过调节下游基因或铁死亡相关基因比如HO-1、GPX4、SLC7A11等抑制铁死亡[20-21]。不同的研究者发现通过上调基因表达或药物促进Nrf2信号通路激活可改善AKI。Luo等[22]发现右美托咪啶通过调节铁死亡和α2-肾上腺素能受体/Keap1/Nrf2/HO-1通路可以预防LPS诱导的AKI。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）是广泛存在于唇形科植物中的多酚类化合物，具有良好的抗氧化和抗炎活性，研究表明通过Nrf2/Keap1通路抑制肾小管上皮细胞铁死亡从而减轻挤压综合征相关AKI[23]。本研究结果与其他研究者一致，CLP诱导的AKI小鼠肾组织中Nrf2蛋白水平明显下降，包括其下游蛋白HO-1，而凉血活血方可以明显提高Nrf2蛋白水平降低，说明它可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制铁死亡发生，减轻氧化损伤从而发挥保护脓毒症AKI作用。
综上所述，本研究结果证实在脓毒症引起的急性肾损伤中，凉血活血方可通过激活Nrf2/HO-1轴，有效提高GSH、SOD水平，减少MDA产生，上调铁死亡抑制蛋白GPX4、SLC7A11的表达，从而减轻脓毒症诱导的急性肾损伤中铁死亡的发生，在脓毒症AKI的治疗中发挥治疗潜力。