摘要
目的：基于Nrf2通路研究点按足三里穴对脾虚腹泻大鼠消化功能、十二指肠组织和肠神经胶质细胞（EGCs）损伤修复的影响及机制。方法：将40只SD大鼠随机均分为四组：空白组、模型组、点穴组、抑制剂组，空白组每日食水自由，其余三组建造脾虚腹泻模型。造模成功后，点穴组和抑制剂组进行点穴干预2周。抑制剂组于首次点穴干预前1 d腹腔注射Nrf2通路抑制剂鸦胆子苦醇2 mg/kg。观察各组大鼠体质量、足趾抓力、腹泻指数及血清胆囊收缩素（CCK）水平；将大鼠十二指肠组织进行HE染色和免疫荧光染色，应用电镜检测EGCs超微结构；应用蛋白质印迹法（Western blot）及Real-time PCR法检测机械生长因子（MGF）、Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）、核因子E2相关因子（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1）、S100β蛋白和mRNA表达量。结果：与空白组比较，模型组大鼠体质量降低，足趾抓力降低，腹泻指数增加，血清CCK降低（P＜0.01），消化道黏膜严重损伤，EGCs超微结构中细胞形态破坏，Keap1、Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达降低（P＜0.01），S100β蛋白和mRNA表达升高（P＜0.01），MGF蛋白和mRNA表达无变化（P＞0.05）；与模型组比较，点穴组大鼠体质量增加，足趾抓力增加，腹泻指数降低，血清CCK升高（P＜0.01），消化道黏膜和EGCs损伤状态较轻，MGF、Keap1、Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达上调，S100β蛋白和mRNA表达降低（P＜0.01）；与点穴组比较，抑制剂组大鼠体质量减低，足趾抓力降低，腹泻指数增加，血清CCK降低（P＜0.01），消化道黏膜和细胞形态破坏严重，Keap1、Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达降低，S100β蛋白和mRNA表达升高（P＜0.01）；与模型组相比，抑制剂组MGF蛋白和mRNA表达增高（P＜0.01）。结论：点按足三里穴可增加大鼠体质量和肌力，改善腹泻状态，恢复十二指肠组织生理形态及EGCs超微结构；其作用机制可能是通过MGF及下游Nrf2通路上调EGCs增殖分化。
关键词
Abstract
Objective To investigate the effects and mechanisms of acupoint pressing at Zusanli (ST36) on digestive function, duodenal tissue and EGCs injury repair in rats with spleen deficiency diarrhea based on the Nrf2 pathway. Methods Forty SD rats were randomly divided into four groups.：the blank group, the model group, the acupoint group, and the inhibitor group. The blank group was allowed free access to food and water daily, while the other three groups were used to establish a spleen deficiency diarrhea model. After successful modeling, the acupoint group and the inhibitor group received acupoint intervention for 2 weeks. The inhibitor group was intraperitoneally injected with Nrf2 pathway inhibitor Bruceine D at a dose of 2 mg/kg one day before the first acupoint intervention. Their weight、diarrhea index and toe grip strength was measured. Histological analysis was performed using HE staining and immunofluorescence staining. The serum CCK level, EGCs ultrastructure, and expression levels of MGF, Keap1, Nrf2, HO-1, S100β protein and mRNA were also measured. Results Compared with rats in the control group, rats in the model group showed severe damage to the gastrointestinal mucosa, weight and muscle strength loss, increased diarrhea index (P<0.01), reduced serum CCK (P<0.01). EGCs exhibit cellular morphology disruption. Expressions of Keap1, Nrf2, HO-1 protein and mRNA were all reduced (P<0.01), S100β protein and mRNA were upregulated (P<0.01). while MGF protein and mRNA showed no significant change (P>0.05). Compared with rats in model group, The acupuncture group rats gastrointestinal mucosal and EGCs damage were less severe. The rats showed weight and muscle strength gain and reduced diarrhea index (P<0.01). Serum CCK was increased (P<0.01). The expression of MGF, Keap1, Nrf2, HO-1 protein and mRNA were upregulated, S100β protein and mRNA were reduced (P<0.01).Compared with rats in the acupuncture group，The inhibitor group showed severe gastrointestinal mucosal and EGCs damage, weight and muscle strength loss, and increased diarrhea index (P<0.01). Serum CCK levels were lower(P<0.01). The expression of Keap1, Nrf2, HO-1 protein and mRNA was reduced, S100β protein and mRNA were upregulated (P<0.01).Compared with rats in model group, the expression of MGF protein and mRNA were upregulated (P<0.01). Conclusion Acupressure at ST36 can improve body weight and muscle strength, alleviate diarrhea, and restore the pathological morphology of duodenal tissue and the ultrastructure of EGCs in rats with spleen deficiency. Its mechanism of action may be to up-regulate the proliferation and differentiation of EGCs through MGF and the downstream Nrf2 pathway.
Keywords
慢性非感染性腹泻为临床内科常见病，多因饮食失调、劳累过度等致积久伤脾，脾虚而泄，严重影响患者生活质量。西医认为其原因为肠道菌群失调，肠道平滑肌痉挛，蠕动活跃，其病理变化为肠黏膜炎症水肿和肠道动力异常[1]。近年研究发现，十二指肠中肠神经胶质细胞（enteric glial cells，EGCs）在胃肠道运动和肠道炎症的调节中起关键性作用，它具有营养支持和保护肠神经元的作用[2-3]。西医治疗多采用调整菌群、肠黏膜吸附剂、解痉止痛药物等方法。针灸推拿疗法在脾虚腹泻治疗方面有其独到之处，尤其重视足三里穴的作用，后世医家多用该穴进行针灸治疗，但关于点穴推拿治疗脾虚腹泻的动物实验研究相对较少。本研究将探索核因子E2相关因子（Nrf2）通路介导下点按足三里穴对脾虚腹泻大鼠消化功能的影响及机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选取SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（210±20）g，5周龄，动物许可证编号：SCXK（京）2019-0002，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国医学科学院放射医学研究所，本研究已通过天津医院伦理委员会审查（批号：2023医伦审143）。
1.2 主要试剂及仪器
FB自动内校电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），数字-模拟压力传感系统（香港艾固仪器仪表有限公司），E100生物显微镜（日本尼康公司），HT7800透射电子显微镜（日本日立公司），BX53荧光显微镜（日本奥林巴斯公司），RT-6100酶标分析仪 （美国Rayto科技公司），脱水机与包埋机（武汉俊杰电子有限公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。
1.3 大鼠分组和处理
1.3.1 大鼠模型制备
将40只大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组、模型组、点穴组、抑制剂组，每组10只，空白组每日食水自由，其余三组建造脾虚腹泻模型[4]，造模9 d后，大鼠出现进食量减少、抓力下降、不喜活动、迟钝乏力、体质量减轻、便溏及脱肛、嗜睡扎堆，毛色不荣等症状，符合评定标准[5]，提示造模成功。抑制剂组于首次点穴干预前1 d腹腔注射Keap1-Nrf2通路抑制剂鸦胆子苦醇（BRU）2 mg/kg。
1.3.2 干预及取材
造模成功后当天进行干预，模型组、点穴组、抑制剂组大鼠俯卧位四肢固定，以异氟烷吸入麻醉[6]。后两组每天在固定时间进行点穴处理，应用已设置参数的压力传感器轮流点按双侧足三里穴[7]（力度参照既往研究资料[8]及本人预实验中[9]压力参数科学换算），预设压力值为0.5 N，力量维持时间15 s，每次操作10个周期，周期间隔5 s，1次/d，共干预2周。空白组只作同步捆绑固定，不做其他处理，然后同步取材。干预期间每天评定腹泻指数。干预结束后，检测4组大鼠体质量和足趾抓力，麻醉后取材：1）取血，开腹钝性分离出腹主动脉，取5 mL动脉血，室温静置，离心，-20℃冰箱保存。2）取十二指肠组织，放置于-70℃超低温冰箱内冻存待测。
1.4 检测指标
1.4.1 基本情况
检测大鼠的体质量、足趾抓力，并记录各组大鼠每日早9：00的粪便形态、颜色、次数、粪便直径等指标，评定其腹泻指数[10]。
1.4.2 血清胆囊收缩素（CCK）
取冻存的血清，参照试剂盒说明书，应用ELISA法检测血清CCK水平。
1.4.3 HE染色
取大鼠十二指肠组织样本，置于固定液中24 h以上，脱水浸蜡，石蜡包埋，制作切片，切片封片后脱蜡至水，染色并脱水封片，显微镜观察并采集图像进行分析。
1.4.4 免疫荧光染色检测S100β阳性细胞数
取大鼠十二指肠组织，石蜡切片脱蜡至水，进行抗原修复，洗涤后加一抗，再次洗涤，加二抗后两次孵育，冲洗后封片完成制作并拍照，测定荧光强度。
1.4.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测组织中机械生长因子（MGF）、Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）、Nrf2、血红素氧合酶-1（HO-1）、S100β蛋白表达量
取大鼠十二指肠组织，加入裂解液研磨，离心后取上清液，采用BCA法测定蛋白含量，电泳，转膜，封闭60 min，一抗孵育后，用TBST洗涤3次，二抗孵育后洗涤，发光试剂显影，自动成像，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参基因GAPDH蛋白的比值作为其相对表达量。
1.4.6 Real-time PCR法检测组织中MGF、Keap1、Nrf2、HO-1、S100β mRNA表达量
取大鼠十二指肠用组织，提取总RNA，用分光光度计检测RNA浓度及纯度，进行反转录定量PCR，按照反转录反应体系条件进行，进行40个循环的扩增以U6为内参，采用ΔΔCT法处理结果。
1.4.7 观察EGCs超微结构
取大鼠十二指肠组织，于戊二醛中固定并漂洗，冰箱固定，后脱水包埋，对所需位置超薄切片，醋酸铀酰染色及柠檬酸铅染色，吸干，最后镜下观察拍照。
1.5 统计学方法
选取SPSS 24.0软件进行统计学分析。实验数据采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠体质量、足趾抓力及血清CCK水平比较
干预2周后，模型组大鼠的体质量、足趾抓力及血清CCK低于空白组，点穴组的体质量、足趾抓力及血清CCK高于模型组，抑制剂组的体质量、足趾抓力及血清CCK低于点穴组，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。
表1各组大鼠体质量、足趾抓力及血清CCK比较
注：a与空白组相比，P＜0.01；b与模型组相比，P＜0.01；c与点穴组相比，P＜0.01
2.2 各组大鼠腹泻指数比较
造模前，四组腹泻指数评分差异无统计学意义（P＞0.05）。干预结束后（第14天），与空白组相比，模型组腹泻指数显著升高（P＜0.01），随着点穴干预进行（第2~14天），点穴组大鼠腹泻指数呈下降趋势，干预结束后（第14天），点穴组腹泻指数低于模型组和抑制剂组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。
图1各组腹泻指数评分比较
2.3 各组大鼠十二指肠黏膜组织病理
空白组的十二指肠黏膜组织结构完整清晰，细胞光滑饱满；模型组黏膜结构模糊、萎缩、糜烂、部分细胞间隙增宽；点穴组肠黏膜细胞组织结构较清晰，萎缩、糜烂等现象较模型组轻；抑制剂组肠黏膜损伤较点穴组严重，见图2。
图2各组大鼠十二指肠黏膜组织病理图（HE染色，×200）
2.4 各组大鼠S100β阳性细胞数比较
与空白组比较，模型组S100β阳性细胞数升高；与模型组比较，点穴组S100β阳性细胞数降低；与点穴组比较，抑制剂组S100β阳性细胞数升高，差异均有统计学意义（P＜0.01），见图3。
图3各组免疫荧光S100β染色情况及阳性细胞数比较
2.5 各组大鼠MGF、Keap1、Nrf2、HO-1、S100β蛋白及mRNA水平比较
与空白组相比，模型组Keap1、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达量降低，S100β蛋白及mRNA表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.01），MGF蛋白及mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，点穴组MGF、Keap1、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达量均升高，S100β蛋白及mRNA表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；抑制剂组Keap1、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达量低于点穴组，S100β蛋白及mRNA表达量高于点穴组，MGF蛋白及mRNA表达量高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4。
图4各组蛋白表达及PCR检测结果比较
2.6 EGCs超微结构检测结果
空白组细胞结构完整，核膜清晰，胞核内常染色体居多，形态正常且均匀分布，细胞质中线粒体丰富；模型组细胞核内异染色体居多，且染色质凝缩、分布不均，胞质中线粒体减少甚至出现空泡化；点穴组细胞形态基本正常，核内染色质分布欠均匀，胞质中线粒体减少；抑制剂组与模型组无明显差异，见图5。
图5各组电镜下EGCs超微结构（×5000）
3 讨论
《内经》认为：脾主运化水湿和水谷精微，脾虚大鼠腹泻原因可能是其消化道平滑肌存在一定结构的损伤以及线粒体呼吸链能量代谢的障碍[11-12]，Keap1-Nrf2通路是调节线粒体再生和氧化磷酸化的重要通路[13]（以下简称Nrf2通路），它能够转录激活相关蛋白，诱导一系列抗氧化抗炎应激反应，发挥保护细胞作用[14]。而足三里穴是治疗脾虚腹泻最常用穴位之一[15]，实验证实针刺该穴疗法可通过调节Nrf2通路蛋白表达而改善大鼠脾虚腹泻状态[16]。
CCK作为肠道神经系统的激素和递质，能够敏锐反映出肠道蠕动功能异常[17]，EGCs是肠道神经系统的主要成分，具有改善胃肠功能、维持胃肠道稳态作用，可以独立调节胃肠神经活动，实验研究已表明胃肠功能紊乱与EGCs的损伤息息相关[18]，该细胞具有多种标志物蛋白，其中S100β蛋白在EGCs中呈高特异性表达，其表达量与EGCs损伤呈正相关[19]。既往实验表明，Nrf2通路能够直接影响EGCs活化和相关蛋白表达[20]，进而影响消化功能，本研究设立Nrf2通路抑制剂组，目的在于观察Nrf2通路对脾虚腹泻大鼠消化功能的重要影响。
本研究中，HE染色、EGCs超微结构及相关蛋白S100β结果可以看出，与空白组相比，模型组十二指肠黏膜组织结构，EGCs的染色体、染色质和线粒体可见损伤和异常状态，S100β阳性细胞数增高，由此可见造模成功；与模型组相比，点穴组黏膜组织萎缩糜烂较轻，EGCs细胞形态、核内及胞质受损状况得以修复，细胞相关性蛋白阳性细胞数降低，可见点按足三里穴具有恢复消化道组织细胞正常形态的作用。
既往动物实验表明，体表穴位刺激可以促进修复EGCs超微结构并改善消化功能[21]。MGF具有力学敏感性[22]，外界应力刺激可提升MGF表达，进而激活蛋白激酶Cε，上调Nrf2通路[23]，促进相关细胞增殖和修复[24]。本研究中，点穴组的十二指肠组织MGF、Keap1、Nrf2、HO-1、蛋白和mRNA表达明显高于模型组，血清CCK水平增高，可见点穴这一良性力学刺激可以诱导MGF高表达，从而上调Nrf2通路，激活抗氧化诱导酶HO-1表达[25]，S100β蛋白和mRNA表达降低，也反映出点穴刺激的抗炎和保护EGCs的作用，进而助力恢复了肠道功能；而抑制剂组在注射BRU并进行点穴后，MGF蛋白和mRNA表达虽然高于模型组，Nrf2通路及下游HO-1蛋白和mRNA表达却明显低于点穴组，血清CCK水平也降低，可见该组点穴干预虽然触发了MGF的高表达，但并没有激活该通路和下游抗氧化酶蛋白和mRNA表达，通路抗氧化反应启动受阻，十二指肠黏膜炎症和EGCs的染色体和细胞器依旧处于损伤状态，损伤标志蛋白S100β大量释放，肠道功能恢复困难，这与Nrf2通路表达受阻有直接关系。
综上所述，压力传感器对足三里穴规律良性刺激，触发了MGF，进而开启了细胞抗氧化抗炎反应，组织能量代谢功能得到恢复，脾虚腹泻大鼠十二指肠组织病理形态得以修复，受到破坏的EGCs超微结构得到改善，其作用机制可能与MGF激活后，Nrf2核转位，并顺序上调Nrf2通路各个节点，激活下游抗氧化酶，促使靶细胞增殖分化，进而修复消化功能有关。近年来，经络点穴疗法越来越受到重视[26]，而本研究为脾虚腹泻治疗提供新的治疗策略及理论依据。未来还需深入研究点穴干预的最优方案（如力度、时长、频率），为脾虚腹泻患者提供更多希望。同时，还需深入研究点穴疗法对其他信号通路的影响，以全面深入地揭示其治疗脾虚腹泻的作用机制。