摘要
目的：探讨加味旋覆代赭汤（JXDD）通过线粒体转录因子A（TFAM）-线粒体DNA（mtDNA）信号通路调控线粒体氧化磷酸化功能抑制食管癌前病变的作用机制。方法：100只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、西药组、JXDD低剂量组、JXDD高剂量组。除正常组，其余组建立食管癌前病变模型并予以相应药物治疗8周。末次给药后取材，苏木精-伊红（HE）染色观察食管组织病理学；蛋白质印迹法（Western blot）检测组织中mtDNA编码蛋白细胞色素氧化酶（COX）1和COX2、TFAM表达；酶联免疫吸附法（ELISA）检测组织中细胞质基质内TFAM表达；定量聚合酶链式反应（qPCR）检测mtDNA拷贝数。构建食管癌前病变及食管癌前病变热休克蛋白70（HSP70）敲低细胞模型，利用Western blot检测细胞内HSP70、细胞质基质及线粒体内TFAM表达、qPCR检测mtDNA拷贝数进行验证。结果：与模型组比较，JXDD治疗后食管黏膜组织增生与炎症细胞浸润减轻，病理评分降低（P＜0.05）；Western blot、ELISA、qPCR结果显示JXDD组食管组织线粒体内TFAM表达升高（P＜0.05），细胞质基质内TFAM表达降低（P＜0.05），mtDNA拷贝数升高（P＜0.05），mtDNA相关编码蛋白COX1与COX2表达增加（P＜0.05）。成功构建对应细胞模型，Western blot和qPCR成功验证JXDD降低细胞质基质TFAM表达、增加线粒体内TFAM表达、增加mtDNA拷贝数（P＜0.05）。结论：加味旋覆代赭汤促使TFAM在线粒体富集，增加mtDNA拷贝数与表达量，保护电子传递链的完整性，改善线粒体氧化磷酸化，抑制食管癌前病变。
Abstract
Objective To investigate the mechanism by which the Jiawei Xuanfu Daizhe decoction (JXDD) inhibits the progression of esophageal precancerous lesions by regulating mitochondrial oxidative phosphorylation function via the TFAM-mtDNA signaling pathway. Methods 100 male SD rats were randomly divided into a normal group, a model group, a western medicine group, a low-dose JXDD group, and a high-dose JXDD group. Except for the normal group, the other groups were used to establish an esophageal precancerous lesion model and were treated with corresponding drugs for 8 weeks. After the last administration, tissue samples were collected. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathology of esophageal tissue; Western Blot was used to detect the expression of mitochondrial DNA (mtDNA)-encoded proteins COX1 and COX2, as well as mitochondrial transcription factor A (TFAM) in the tissue; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the expression of TFAM in the cytosolic fraction of the tissue; and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was used to measure the mtDNA copy number. Finally, a cell model was constructed, and Western blot was used to detect the expression of HSP70 and TFAM in the cytosolic and mitochondrial fractions, while qPCR was used to measure the mtDNA copy number for verification. Results Compared with the model group, JXDD treatment alleviated hyperplasia of the esophageal mucosa and inflammatory cell infiltration, and reduced the pathological score (P<0.05). Western blot, ELISA, and qPCR results showed that in the JXDD group, TFAM expression in the mitochondria of esophageal tissue increased (P<0.05), while its expression in the cytosol decreased (P<0.05). The mtDNA copy number and the expression of mtDNA-encoded proteins COX1 and COX2 were also increased (P<0.05). An esophageal precancerous lesion cell model was successfully established, and Western Blot and qPCR validated the above findings. Conclusion JXDD inhibits the development of esophageal precancerous lesions by promoting TFAM accumulation in mitochondria, increasing mtDNA copy number and expression, protecting the integrity of the electron transport chain, and ultimately enhancing mitochondrial oxidative phosphorylation function.
食管癌前病变是指食管黏膜在发展为恶性肿瘤前的异常增生阶段，主要包括低级别上皮内瘤变（low grade intraepithelial neoplasia，LGIN）、高级别上皮内瘤变（high grade intraepithelial neoplasia，HGIN）和巴雷特食管伴异型增生等，早期发现和干预是阻断癌变的关键。目前常用治疗手段为抑酸和抗反流[1]。乙酰水杨酸具有一定疗效[2]，但存在不良反应问题[3]。二甲双胍具有潜在疗效[4]，但缺乏临床证据。中医药在食管癌前病变的防治中具有独特优势[5-6]。袁红霞教授团队研究发现加味旋覆代赭汤（Jiawei Xuanfu Daizhe decoction，JXDD）能阻断反流食管炎恶性转化为食管上皮异型增生，并能阻断食管上皮异型增生向癌变，实现炎癌转化全过程阻断。前期研究表明其机制可能为改善线粒体电子传递链功能[7]，恢复氧化磷酸化水平[8-9]，具体机制仍需要进一步研究。
氧化磷酸化依赖于线粒体内膜的电子传递链，其形成受线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）与核DNA（genomic DNA，gDNA）共同调控。mtDNA转录翻译产生的细胞色素氧化酶（COX）1、COX2等13个蛋白质是形成复合体的关键组成部分。线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）负责调控mtDNA的复制与转录[10]，位于基质和线粒体内部，其分布对mtDNA复制与转录有重要影响。TFAM从基质转运至线粒体依赖于热休克蛋白（heat shock protein，HSP）70[11]。TFAM与HSP70结合后，将TFAM从基质转运至线粒体内部[12]，以复制并转录mtDNA，使电子传递链结构保持完整，氧化磷酸化功能维持正常。
研究显示，TFAM在食管癌组织中总体表达较高，但在线粒体中表达较低。这提示TFAM在基质与线粒体中内富集程度不同，从而影响mtDNA复制与转录。基于前期研究提出以下假说：加味旋覆代赭汤通过调控TFAM在线粒体内富集程度，影响mtDNA复制与转录，维持电子传递链完整并改善氧化磷酸化过程，最终抑制食管癌前病变发展。本研究通过体内外实验探索并验证加味旋覆代赭汤的机制，为中医药防治食管癌前病变的临床应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物与细胞
120只8周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2021-0011]，实验方案通过天津市医药科学研究所动物实验伦理委员会审批（编号：IMPS-EAEP-Q-202002）。人食管上皮细胞系Het-1A购自天津百奥思科公司。
1.1.2 实验仪器
高速低温组织研磨仪（上海朗卓生物科技有限公司），实时荧光定量PCR系统（深圳博尔熙科技发展有限公司），超微量分光光度计（杭州佑宁仪器有限公司），化学发光成像系统（杭州科锐创新科技有限公司）。
1.1.3 实验试剂
TFAM抗体（上海艾博抗贸易有限公司），β-actin抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），COX1、COX2、HSP70抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），苏木精-伊红（HE）、CCK8、BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），大鼠线粒体DNA拷贝数测定试剂盒（美国Detroit R&D公司），甲基苄基亚硝胺[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]，Lipofectamine™ 3000（赛默飞世尔科技公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 药物制备
中药配制：JXDD颗粒（天津康仁堂药业有限公司）对应饮片：旋覆花15 g，代赭石5 g，清半夏10 g，生姜25 g，人参10 g，炙甘草10 g，大枣15 g，枳实10 g，生白术30 g，酒大黄6 g。用蒸馏水将颗粒混匀，低剂量组和高剂量组浓缩药液至66 mL和33 mL。造模药配制：将40%肌氨酸乙酯盐酸盐与6%亚硝酸钠（均溶于0.01 moL/L盐酸）按等体积混合，配制后立即使用。西药配制：10 mg雷贝拉唑钠肠溶胶囊（珠海润都制药股份有限公司，国药准字H20050228）和15 mg枸橼酸莫沙必利片（江苏豪森药业集团有限公司，国药准字H19990315）加入蒸馏水混匀至33 mL。
1.2.2 动物造模与给药
100只大鼠适应性喂养1周，分为空白组、模型组、西药组（0.0023 g/kg）、JXDD低剂量组（6.18 g/kg）、JXDD高剂量组（12.36 g/kg），每组20只。空白组灌胃生理盐水，其余四组按1 mL/100 g灌胃现配制的造模药，每周3次，持续3周。第4周注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，沿腹正中线开腹，取出胃及食管，游离相关组织，实施“食管十二指肠端侧吻合术”[13]。结扎贲门，并在其上方横断食管。在幽门下方十二指肠壁上作1~2 mm切口，以便与食管断端缝合。吻合后将胃和食管放回腹腔。切口周围喷洒1 mL盐酸左氧氟沙星注射液以预防感染。缝合伤口后，将大鼠仰卧放回笼中。各组大鼠术后24 h禁食不禁水，术后第7天起，空白组和模型组以0.3 mL/100 g生理盐水灌胃，西药组、JXDD低剂量组和JXDD高剂量组以0.3 mL/100 g西药或对应浓度JXDD按灌胃，每天1次，持续8周。取材前，各组动物禁食不禁水，脱颈处死，取吻合口至上方2 cm处一段食管，用生理盐水清洗后纵切成两份。一份于-80℃保存，用于分子生物实验检测，一份用4%多聚甲醛固定，用于病理检测。
1.2.3 含药血清制备
将大鼠分为给药组和空白组，每组各10只。给药组以高剂量JXDD灌胃（0.3 mL/100 g），空白组给予等体积生理盐水灌胃，每天2次，持续3 d。末次给药后1 h，自腹主动脉取血，于4℃以3000 r/min离心15 min，分离血清，用0.22 μm滤膜过滤，-80℃保存[14]。
1.2.4 细胞转染
将Het-1A细胞接种于6孔板，长至70%~80%融合度时，分别取125 μL Opti-MEM稀释5 μL Lipofectamine™ 3000及4 μL P3000增强剂。另一离心管中，以125 μL Opti-MEM稀释终浓度为50 nmol/L的siRNA。将二者轻柔混合，室温静置15 min形成转染复合物。随后将复合物均匀滴加至细胞培养基中。转染6 h后更换为完全培养基，继续培养48 h后收集细胞，用于后续实验。
1.2.5 CCK8检测含药血清及亚硝胺对食管上皮细胞活性影响
于96孔板接种Het-1A细胞，加入不同体积含药血清培养基（5%、10%、15%和20%）培养相应时间（24、48和72 h），或加入食管癌前病变细胞造模药亚硝胺（10、20、40、60、80和100 μg/L）培养24 h，加入CCK8工作液，孵育1 h后置于450 nm处测定吸光度。
1.2.6 HE染色
将固定后食管组织进行脱水，透明和浸蜡后包埋，3 μm厚连续切片。按说明书进行染色，采用光镜观察食管上皮病理变化，病理分级标准见表1。将食管黏膜病理分级为正常均计为0分。
表1食管黏膜病变病理分级标准
注：正常、轻度、中度、重度c分别计为0、1、2、3分
1.2.7 Western blot检测食管组织内mtDNA编码的蛋白COX1和COX2、线粒体TFAM蛋白、细胞内HSP70、细胞质基质及线粒体内TFAM蛋白表达
剪碎食管组织，取部分加RIPA裂解液研磨，以12 000 ×g离心20 min；取部分组织加低渗裂解缓冲液研磨，800 ×g离心10 min取上清再次以15 000 ×g离心15 min，得上层细胞质基质与线粒体沉淀，线粒体加RIPA裂解液提取蛋白。对组织总上清、组织线粒体样本，细胞总上清、细胞质基质上清及细胞线粒体样本进行BCA法测定蛋白含量。取10 μg蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜。封闭10 min，一抗4℃孵育过夜，TBST清洗后二抗室温孵育1 h显影。Image J软件分析条带灰度值，选择β-actin作为内参蛋白进行归一化处理。
1.2.8 ELISA检测食管组织细胞质基质中TFAM表达
取1.2.7中组织的细胞质基质上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，于450 nm测定吸光度并计算食管组织基质中TFAM表达量。
1.2.9 qPCR检测mtDNA拷贝数
使用基因组DNA提取试剂盒提取组织或细胞总DNA，使用大鼠线粒体DNA拷贝数测定试剂盒进行qPCR检测，操作按照说明书进行。反应条件：95℃预变性10 min；95℃15 s，60℃60 s，40个循环。以gDNA作为对照，2-∆∆Ct法计算mtDNA拷贝数。mtDNA和gDNA的检测引物由美国Detroit R&D公司设计。
1.3 统计学方法
采用SPSS26.0软件进行统计分析，符合正态分布的数据以均值±标准差（）表示，多组间差异采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠一般情况与食管上皮病理改变
空白组大鼠表现出正常的生理与行为特征。其他组大鼠均表现出不同程度的异常症状，包括反流加重、食欲下降、腹部肿胀、粪便黏稠、活动减弱、畏光、聚集等。西药组、JXDD低剂量组、JXDD高剂量组经药物治疗后，大鼠状态改善。实验周期内共18只大鼠死亡，原因见表2。
表2各组大鼠死亡原因分析
光镜下观察各组大鼠食管上皮组织。空白组大鼠食管黏膜状态正常，黏膜被覆角化的复层扁平上皮，组织内未见炎症细胞浸润。模型组大鼠食管黏膜病理改变明显，组织整体结构异常，部分黏膜被覆异型增生细胞，组织内炎症细胞浸润明显。经西药和JXDD治疗，食管黏膜组织增生与炎症细胞浸润明显减轻，说明药物干预对改善食管黏膜病理具有积极效果。与空白组相比，模型组大鼠食管黏膜病理积分显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，西药组、JXDD低剂量组、JXDD高剂量组大鼠食管黏膜病理积分降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与JXDD低剂量组相比，JXDD高剂量组大鼠食管黏膜病理积分降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、表3。
图1各组大鼠食管黏膜病理图（HE染色，×200）
表3各组大鼠食管黏膜病理分级和积分比较
注：a与空白组相比，P＜0.05；b与模型组相比，P＜0.05；c与JXDD低剂量组相比，P＜0.05
2.2 各组大鼠食管组织TFAM及mtDNA拷贝数比较
与空白组相比，模型组线粒体内TFAM表达显著降低，基质内TFAM表达显著升高，mtDNA拷贝数降低，mtDNA编码蛋白COX1和COX2表达显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，西药组及JXDD低剂量组和高剂量组线粒体内TFAM表达升高，基质内TFAM表达降低，mtDNA拷贝数显著增加，mtDNA编码蛋白COX1与COX2表达升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与JXDD低剂量组相比，JXDD高剂量组线粒体内TFAM表达升高，基质内TFAM表达降低，mtDNA拷贝数增加，mtDNA编码蛋白COX1与COX2表达升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2、3及表4。
图2大鼠食管组织线粒体内TFAM蛋白表达电泳
图3大鼠食管组织mtDNA编码蛋白COX1与COX2蛋白表达电泳
2.3 Het-1A细胞中TFAM及mtDNA拷贝数表达情况
含药血清体积为10%、干预时间为24 h对Het-1A细胞活性影响最小，后续采用10%含药血清干预24 h作为处理条件，见图4。亚硝胺能明显抑制Het-1A细胞活性，IC50=50.59 μg/L，后续采用20 μg/L亚硝胺作为造模浓度，见图5。
表4大鼠食管组织线粒体及细胞质基质内TFAM蛋白表达、COX1与COX2蛋白表达及mtDNA拷贝数比较
注：a与空白组相比，P＜0.05；b与模型组相比，P＜0.05；c与西药组相比，P＜0.05；d与JXDD低剂量组相比，P＜0.05
图4不同体积含药血清干预Het-1A细胞活性曲线图
图5不同浓度亚硝胺抑制Het-1A细胞活性曲线图
构建食管癌前病变细胞系与热休克蛋白70敲低（si HSP70）食管癌前病变细胞系。与空白组相比，模型组中HSP70表达降低，基质中TFAM表达升高，线粒体中TFAM表达降低，细胞内mtDNA拷贝数降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，si HSP70模型组中HSP70表达降低，表明化学诱导剂与HSP70低表达具有协同效应，基质内TFAM表达升高，线粒体内TFAM表达降低，胞内mtDNA拷贝数降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；较模型组，JXDD治疗组中HSP70表达升高，基质内TFAM表达降低，线粒体内TFAM表达升高，胞内mtDNA拷贝数升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；较si HSP70模型组，si HSP70模型+治疗组HSP70表达升高，基质内TFAM表达降低，线粒体内TFAM表达升高，胞内mtDNA拷贝数升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图6~8，表5。
3 讨论
基于袁红霞教授多年临床经验，在旋覆代赭汤基础上加入枳术汤与酒大黄，组成加味旋覆代赭汤。枳实配伍白术[15]，调气、健脾、利水，增强原方补中、降逆，调节升降之功效；食管癌前病变属有形增生，不能仅凭调气，因此加酒大黄以化瘀通络，破癥瘕、消积聚。诸药合用和胃降逆、调和气、血、水，从而防止食管癌前病变。
图6食管癌前病变细胞内HSP70蛋白表达电泳
图7食管癌前病变细胞基质内TFAM蛋白表达电泳
图8食管癌前病变细胞线粒体内TFAM蛋白表达电泳
mtDNA对维持细胞呼吸功能至关重要，其复制与转录过程在线粒体内进行，丰度降低被认为是许多疾病的重要特征。TFAM作为线粒体转录因子，缺失或敲低[16]可导致mtDNA拷贝数减少与表达水平降低，进而导致呼吸链缺陷，最终导致线粒体功能障碍及相关疾病。研究表明，在食管癌前病变及其他癌变组织中，TFAM整体高表达[17-19]，这似乎与线粒体电子传递链及氧化磷酸化水平缺陷的情况存在悖论。同时也有研究表明，TFAM整体表达水平并非与mtDNA拷贝数与转录水平正相关[20]。本研究通过体内体外实验发现，TFAM在基质内高表达而在线粒体内低表达，同时mtDNA拷贝数降低，可推测出线粒体内TFAM低表达是食管癌前病变组织的特征。加味旋覆代赭汤治疗后，能显著提高线粒体内TFAM水平。
HSP70是一种高度保守蛋白，分布于细胞质基质及线粒体膜上，在线粒体蛋白质合成后跨膜转运过程中起关键作用。TFAM合成后，依赖HSP70从基质转运至线粒体发挥功能[21]。HSP70缺失将会影响TFAM的转运及正确折叠。随着疾病进展，线粒体中错误折叠的蛋白质过度累积会导致功能异常，这可能是食管癌前病变的发生原因。本研究通过构建siHSP70细胞模型，也证实了随着HSP70表达降低，TFAM在线粒体内富集程度降低。加味旋覆代赭汤治疗后，能显著提高HSP70表达，促进TFAM在线粒体富集。
表5食管癌前病变细胞HSP70、线粒体及基质内TFAM蛋白表达与mtDNA拷贝数
注：a与空白组相比，P＜0.05；b与模型组相比，P＜0.05；c与模型＋siHSP70组相比，P＜0.05
综上所述，本研究证实加味旋覆代赭汤通过提高细胞内HSP70水平，促进TFAM在线粒体内富集，提升mtDNA拷贝数并增强其编码蛋白表达，保护电子传递链完整，优化氧化磷酸化功能，最终抑制食管癌前病变发生与发展。此结果可为加味旋覆代赭汤治疗食管癌前病变提供理论支持。