嵌顿性腹壁疝是常见的外科急腹症，约5%~15%的腹壁疝患者会发生嵌顿，其中嵌顿性腹股沟疝（incarcerated groin hernia，IGH）是最常见的类型之一。当嵌顿疝内容物为肠管时，可导致肠绞窄、进行性肠坏死。研究发现，约15%的IGH因进行性肠坏死需要行肠切除术；肠坏死患者住院时间明显延长，术后并发症发生率高达6%~43%，死亡率达1%~7%^[1-2]。因此，早期识别肠坏死风险并及时进行手术治疗对于嵌顿疝患者的预后至关重要。研究发现，D-乳酸（D-lactic acid，D-LAC）和肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，I-FABP）诊断急性肠缺血的特异性和敏感性高，是早期诊断急性肠缺血最有前景的潜在标志物^[3]。然而对于不同病因导致的急性肠缺血性疾病，D-LAC和I-FABP的诊断准确性仍有争议^[4]。D-LAC和I-FABP能否应用于IGH的早期诊断并作为嵌顿疝肠管缺血或坏死的早期标志物，目前的研究仍然较少。本研究拟通过嵌顿疝动物模型，探讨D-LAC和I-FABP早期识别嵌顿疝肠坏死的应用价值。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

6~8周龄健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠36只，体质量250~300 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。D-LAC和I-FABP酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（泉州市九邦生物科技有限公司）；RNA提取试剂Trizol（Invitrogen公司）和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒（SYBR Green，Sigma-aldrich公司）。

1.2 大鼠嵌顿疝模型制作

SD大鼠禁食12 h，采用2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，采用8%硫化钠行腹壁脱毛、0.5%碘伏消毒皮肤。将SD大鼠随机分为对照组和实验组，每组18只。实验组：取下腹正中切口长约3 cm，将距回盲瓣2 cm的末端回肠牵拉出，作为待嵌顿肠管，标记并测量待嵌顿部位肠管直径（d）。参照文献^[5]并改进嵌顿疝模型：腹壁肌层切口制作人工疝环，疝环直径（D）=0.8×d；将待嵌入肠管经疝环牵出，嵌入肠管长度为8 d；用4-0丝线缝合除人工疝环外的腹壁肌层；游离皮肤与腹壁肌层间隙，将嵌入肠管留置于皮下腔隙内，4-0丝线连续缝合皮肤并确保皮肤缝合后对嵌入肠管无压迫。对照组：下腹正中切口长约3 cm，将距回盲瓣2 cm的末端回肠牵拉出直接置于皮下间隙（嵌入肠管长度同实验组），然后缝合关闭皮肤。观察术后大鼠存活情况，伤口局部感染情况、腹部体征及全身表现情况。

1.3 ELISA法检测血清D-LAC和I-FABP水平

在术后30 min、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h，分别从两组中随机选取3只大鼠，自眼眶取血0.5 mL，离心取血清，采用ELISA试剂盒检测血清中I-FABP、D-LAC水平的变化。

1.4 RT-qPCR法测定I-FABP的表达水平

在术后30 min、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h，取两组嵌顿肠管组织，用Trizol提取总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，应用SYBR Green法进行RT-qPCR，参照说明书，检测各时间点两组嵌顿肠管组织中I-FABP的表达水平。

1.5 嵌顿肠管病理学检测及评分

在术后30 min、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h，取两组嵌顿肠管组织，观察嵌顿肠管形态学变化；苏木素伊红（hematoxylin，HE）染色观察肠管病理学变化，采用Chiu’s病理评分标准评价小肠损伤情况^[6]。

1.6 统计学分析

数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据采用$\stackrel{-}{x}\pm s$表示，比较采用单因素方差分析或t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠肠管大体标本观察

实验组嵌顿肠管，术后30 min和2 h肠管颜色无明显变化，肠蠕动明显；4 h时，部分肠管及肠系膜水肿并出血点形成，肠蠕动减弱；6 h时，肠管颜色呈灰色与未嵌顿腹腔内肠管相比色差明显，经外界刺激后可见部分肠蠕动；8 h时，嵌顿肠管颜色成深灰色可见出血点，肠管及系膜水肿及渗出明显，刺激后肠蠕动不明显；12 h时，嵌顿肠管颜色进一步加深，对外界刺激无反应，肠壁水肿并张力增高，肠系膜内无动脉搏动。因此推断，术后6 h时，嵌顿肠管血运障碍明显呈典型肠绞窄表现；8 h时嵌顿肠管逐渐向肠坏死过度；12 h时呈现明显肠坏死特征，见图1。对照组所有大鼠在实验过程中，皮下间隙内的肠管颜色、肠壁及系膜水肿、肠蠕动情况等均与腹腔内正常肠管无明显差异。这说明成功建立了大鼠嵌顿疝模型，并可用该模型进行后续实验。

2.2 血清D-LAC和I-FABP水平变化

在术后6个时间点，对照组血清D-LAC和I-FABP水平无明显变化；而实验组呈逐渐升高趋势，术后6 h时D-LAC开始明显升高，术后8 h时I-FABP开始明显升高。在术后6 h、8 h和12 h，实验组血清D-LAC高于对照组，差异有统计学意义[（514.35±4.62） μg/L vs（267.73±2.31）μg/L，P=0.002；（937.34±11.55）μg/L vs（276.99±33.88）μg/L，P=0.012；（2019.60±16.17）μg/L vs（273.18±14.63）μg/L，P=0.001）]。在术后8 h和12 h，实验组血清I-FABP高于对照组，差异有统计学意义[（555.49±2.75）μg/L vs（220.14±0.92）μg/L，P=0.001；（1210.94±5.96）μg/L vs（220.46±9.63）μg/L，P=0.001]。见图2。

2.3 RT-qPCR测定I-FABP的表达

在术后6个时间点，对照组I-FABP的表达无明显变化；而实验组则逐渐呈升高趋势，在8 h和12 h时表达最高。在术后2、4、6、8、12 h，实验组I-FABP高于对照组，差异有统计学意义[（2.05±0.79）μg/L vs（0.93±0.20）μg/L，P=0.001；（5.51±0.35）μg/L vs（1.00±0.13）μg/L，P=0.002；（5.99±0.15）μg/L vs（1.04±0.16）μg/L，P=0.001；（8.20±0.60）μg/L vs（0.97±0.55）μg/L，P=0.002；（8.20±0.60）μg/L vs（1.13±0.16）μg/L，P=0.001]。见图3。

2.4 嵌顿肠管病理学检测

术后4 h、6 h、8 h和12 h，实验组大鼠肠管Chiu’s病理评分高于对照组，差异有统计学意义（3.00±1.00 vs 0.67±0.58，P=0.036；3.67±0.58 vs 0.67±0.58，P=0.003；4.33±0.58 vs 0.67±0.58，P=0.001；4.67±0.58 vs 1.33±0.58，P=0.002，图4）。HE染色显示，在术后6 h时，实验组部分大鼠嵌顿肠管开始出现肠黏膜上皮细胞层变性坏死、脱落，部分绒毛脱落，毛细血管扩张充血（图5A）；术后12 h，实验组大鼠嵌顿肠管出现绒毛脱落、固有层裸露或崩解，出血或溃疡形成（图5B）。对照组大鼠肠管在术后各时间点HE染色则表现为绒毛正常或仅有毛细血管充血。

3 讨论

嵌顿疝常伴有肠梗阻和潜在的肠绞窄、坏死等严重并发症。尤其在老年患者，嵌顿时间、腹部症状及体征往往不能准确反映肠管的病理变化。中医学理论中，气滞血瘀型是绞窄性肠梗阻或肠坏死的中医证型^[7]。但当患者出现典型的腹部体征、影像学表现及中医证型时，嵌顿肠管已处于不可逆的缺血改变，错过最佳治疗时机^[8]。诊疗的延误是导致嵌顿疝伴肠坏死高死亡率的重要因素，然而肠坏死的及时诊断仍是疝外科的难题之一，目前临床上尚无有效的早期诊断标准^[9]。

肌酸激酶（creatine kinase，CK）可作为预测肠梗阻是否发生肠绞窄和坏死的预测指标之一^[10]。但是，肠缺血坏死首先从黏膜层开始，而CK位于肠平滑肌中，并且血清CK是否升高与肠管缺血面积、CK释放入腹腔以及门静脉或腹膜吸收和清除速度等因素有关。当绞窄坏死肠管范围小或非闭塞性肠系膜缺血时，血清中CK水平对早期肠坏死和缺血的敏感性较低^[11]。本研究中嵌顿肠管长度仅4～5 cm左右，因此本研究未选取血CK作为研究指标。

在本实验嵌顿疝模型中，肠管在嵌顿6 h时出现了血运障碍、肠黏膜上皮坏死，血D-LAC水平升高；嵌顿8 h时肠管逐渐开始呈坏死表现，血D-LAC继续升高；12 h时嵌顿肠管呈典型坏死表现，血D-LAC水平达最高。D-LAC是肠道固有细菌发酵产生的代谢终产物，当肠黏膜通透性增加、肠黏膜屏障功能下降时，可进入血液循环，并在肝内不分解。Murray等^[12]在大鼠绞窄性肠梗阻和肠缺血模型中证实了血D-LAC升高有助于诊断急性肠缺血。Nielsen等^[13]在急性猪肠缺血模型中也证实了上述情况。Meta分析发现D-乳酸诊断急性肠系膜缺血的灵敏度和特异度分别为71.7%和74.2%^[14-15]。

I-FABP是肠上皮细胞分泌的一种水溶性蛋白质，主要位于小肠黏膜层。当发生肠黏膜缺血时I-FABP可释放入血，因此I-FABP有助于早期诊断肠缺血的发生^[16]。由于I-FABP入血后可被肾脏代谢清除，研究发现，尿I-FABP诊断早期肠系膜缺血的灵敏度和特异度分别为90%和89%^[17]；血I-FABP在急性肠系膜缺血诊断的灵敏性和特异度分别为75%和85%^[15，18]。本研究发现，嵌顿肠管在2 h时，已发现I-FABP明显表达；但是直到8 h肠管开始呈坏死表现时，才能检测到比对照组更高水平的I-FABP。原因可能是当肠缺血早期或坏死局限于黏膜下层时，I-FABP释放入血量少，并且I-FABP入血后被肾脏清除。

目前，关于D-LAC和I-FABP诊断急性肠缺血疾病的临床研究报道，纳入了各种不同的急腹症，如急性肠系膜动脉或静脉栓塞、单纯性或绞窄性肠梗阻、缺血性肠炎等^{[4，14，18]}。因此，疾病的异质性和研究病例数少等因素导致上述临床研究结果仍有争议。Shi等^[19]的研究中纳入了29例绞窄性肠梗阻，Kanda等^[20]的研究中纳入了30例绞窄性肠梗阻和15例嵌顿疝，两项研究均发现D-LAC和I-FABP可作为诊断急性肠缺血的有效指标。嵌顿疝的临床进程是单纯性肠梗阻向绞窄性肠梗阻、肠坏死过渡的病理过程。本研究结果也表明，血清D-LAC和I-FABP的水平变化与嵌顿肠管的病理表现一致。

综上所述，血D-LAC和I-FABP水平升高对早期诊断嵌顿疝发生肠坏死提供了临床研究的依据。关于D-LAC、I-FABP等血清标志物在诊断嵌顿疝肠坏死中的临床研究，将有助于外科医生的临床决策，改善嵌顿疝患者的预后。

参考文献