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1943年，应用血液透析（hemodialysis，HD）治疗并延长终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）患者生存时间成为一种新的有效方法[1]。Brescia等[2]首次创立了AVF手术，是长期HD患者首选血管通路技术。当前动静脉瘘（arteriovenous fistula，AF）失败率逐渐增长，通畅率有降低趋势[3]。AVF失败的关键因素是内瘘处血管内膜增生（intimal hyperplasia，IH）。现阶段用于降低IH增长和AVF失败的措施有限且效果较差，药物和机械再通措施治疗AVF血管内膜增生导致的管腔狭窄仍有较高的失败率和再狭窄率[4-6]。基于以上问题，寻找能够有效治疗AVF血管内膜增生的药物并研究其作用机制对于HD患者有重大意义。有研究应用局部外用药物，通过给予AVF瘘管处更高剂量的药物浓度能够治疗IH，同时避免内服治疗药物所导致的不良反应[7]。
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在中医传统理论中，AVF瘘管失败属于“脉痹”一证，经脉不通、脉络瘀阻是其主要的病机特点。本课题组结合全国名老中医王玉林教授的经验，创立治疗AVF血管内膜增生的方药——桂龙护瘘酊（GT），该方具有温通经脉、活血祛瘀及消肿止痛等功效[8]。我院肾内科血透室长期使用GT防止内瘘患者IH，已经取得了较好的临床疗效[9-10]。但针对GT治疗内瘘处IH的具体作用机制研究则较少。本研究采用网络药理学方法，对GT治疗AVF内瘘处IH的潜在成分靶点进行分析，构建“药物成分-靶点-通路”网络图，展示其对内瘘处IH的潜在靶点及作用机制，得出GT复方多成分、多靶点和多通路治疗AVF血管内膜增生的特点。而且，进一步使用分子对接验证其结果，为充分研究其治疗AVF血管内膜增生机制奠定基础。
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1 资料与方法
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1.1 GT活性成分筛选及靶点预测
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采用HERB数据库[11]，分别以“肉桂”“地龙”“乳香”“没药”“红花”为关键词，搜索得到GT方中所含的化学成分。按Lipinsk五原则[12-13]（MW≤500，xLogP≤5，nOHNH≤5，nOH≤10）筛选GT方的中药物成分。利用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[14]筛选出成分的Ingredient_Smile，利用swissadme[15]进一步筛选，并按LogkP值对药物成分排序，对前20位的成分用Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch）[15]进行靶点预测，按Probability>0.1筛取靶点。
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1.2 AVF血管内膜增生疾病靶点与交集靶点获取
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利用GeneCards数据库（https://www.genecards.org）[16]、Pharmgkb数据库（https://www.pharmgkb.org）[17]及OMIM数据库（https://omim.org）[18]筛选获得疾病相关靶点信息。利用Venn在线网站[19]（http://www.bioinformatics.com.cn），导入药物-疾病靶点基因得到GT-AVF血管内膜增生二者的交集靶点Venn图。
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1.3 PPI网络构建
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采用String平台（https://string-db.org）对药物-疾病交集靶点做蛋白互作关系，将物种选择为“人”选项，设置0.4的最低置信度[20]，下载TSV文件保存，并应用Cytoscape3.9.1软件[21]对行蛋白互作关系得到的交集基因构建PPI网络。
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1.4 药物成分-靶点-通路-疾病网络构建
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为了更好地展示网络药理学研究结果，利用Cytoscape3.9.1软件[21]将GT方中药物构建“药物成分-靶点-通路-疾病”为节点的五者相互关系可视化网络模型。
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1.5 GO功能分析与KEGG富集分析
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利用DAVID数据库[22]中对药物-疾病交集靶点基因作富集分析，明确交集靶标生物学功能。在DAVID数据库中选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”“Gene List”“Homo Sapiens”提交基因列表，进行GO（gene ontology）生物学过程富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路分析，从“Functional Annotation Chart”板块下载生物学过程、通路富集结果[22]。在微生信平台选用柱状图和气泡图对上述结果建立可视化统计图。
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1.6 成分-靶点分子对接验证
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1.6.1 下载小分子配体和蛋白受体
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利用PubChem数据库[14]依次下载（-）-Limonene、（-）-alpha-Pinene、Tridecanoic acid化合物2D结构的sdf格式文件[14]。利用RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org）[23-24]下载NOS3基因的高分辨率3D结构[25]pdb格式文件。
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1.6.2 准备结合配体和受体
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利用Chem3D依次打开三个化合物2D结构的sdf格式文件对其进行能量最小化操作，并保存为mol2格式文件，利用AutoDockTools对mol2文件作显示配体结合的跟，配体可旋转的键操作，保存为pdbqt格式文件[26]。利用PyMOL中打开NOS3基因3D结构pdb格式文件，删除蛋白结构中的水分子、其他小分子配体，并保存A链的pdb格式文件[27]，利用AutoDockTools软件对其进行加氢，计算蛋白电荷及添加蛋白原子类型，导出并保存结果为pdbqt格式文件[28]。
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1.6.3 确定分子对接区域
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利用AutoDock打开NOS3基因蛋白的pdbqt文件，调整为二级结构显示蛋白，单纯显示蛋白[28]，根据NOS3基因蛋白的参考文献确定作用位点，调整Grid Box的中心坐标和长宽高[25]。
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1.6.4 结果可视化
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建立配置文件后进入命令模式并输出结合点vina.pdbqt文件，使用OpenBabel软件将其转化为pdb文件[29]，利用Pymol对关键靶点基因蛋白和成分结构蛋白做分子对接，并导出化合物成分-蛋白分子对接结果[27]，在PLIP（https://projects.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index）[30]网站进行结合位点可视化，最后利用Pymol软件进一步调整残基标记结合位点位置。
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2 结果
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2.1 GT药物活性成分筛选及靶点预测结果
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通过HERB数据库分别检索肉桂、乳香、没药、红花，共得到1233个成分，其中215个来自肉桂，170个来自乳香，601个来自没药，247个来自红花，地龙的化学成分并未在该数据库中查到，通过文献共查到地龙成分203个。按Lipinsk五原则（MW≤500，miLogP≤5，nOHNH≤5，nOH≤10）对以上药物成分进行筛选，剔除未能预测到成分靶点的化合物，得到活性化合物共554个，其中肉桂119个，乳香82个，没药217个，红花92个，地龙44个。使用PubChem数据库筛选成分的Ingredient_Smile，利用swissadme进一步筛选，并按LogkP值对药物成分排序，取前5位成分列出（表1），其中（-）-Limonene、（-）-alpha-Pinene为肉桂、乳香共同活性成分，Tridecnoic acid为地龙、没药共同活性成分，用Swiss Target Prediction数据库对排名前20位的成分进行靶点预测，得到GT5味药中，共100个活性成分和1882个靶点（P>0.1），去重后得到81个活性成分，576个成分靶点（P>0.1）。
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2.2 AVF血管内膜增生疾病靶点搜集与交集靶点获取
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将AVF血管内膜增生作为关键词在GeneCards、Pharmgkb、OMIM数据库检索，共得到608个AVF血管内膜增生相关的疾病靶点。利用Venn在线网站得到GT-AVF血管内膜增生的Venn图和30个交集靶点（图1、表2）。
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2.3 PPI网络构建
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利用String平台对30个交集靶点构建蛋白互作关系（图2），利用Cytoscape3.9.1软件对30个交集靶点做PPI网络拓扑分析，靶点基因degree值以靶点之间节点的颜色和大小反映，节点越大、靶点颜色越亮，代表该节点度值越大；以连线的颜色和粗细表示结合分数（combine_score）的大小，颜色越暗、线条越粗，则节点间的联系越紧密。采用MCODE插件筛选Hub基因，黄色代表网络得分最高，即黄色是网络中最关键和典型的基因。PPI网络拓扑分析获得ACE、PPARG、CXCL8、NOS3、MTOR、HMOX1、TGFB1等关键靶点（图3）。
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2.4 药物成分-靶点-基因-通路-疾病网络构建
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将GT中所含的五味中药、成分、靶点、通路、疾病等信息录入Cytoscape3.9.1软件中，构建以“药物成分-靶点-通路-疾病”节点的五者相互关系可视化网络模型。图中蓝色为中药（肉桂、地龙、乳香、没药、红花），橙色为肉桂成分，浅绿色为地龙成分，灰色为乳香成分，浅蓝色为没药成分，深蓝色为红花成分，红色为交集基因靶点，绿色为通路，紫红色为疾病（AVF血管内膜增生），相连的边形成的网络表示“药物成分-靶点-基因-通路-疾病”相互作用关系（图4）。
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图1 药物靶点和疾病靶点韦恩图
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图2 蛋白互作关系
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图3 PPI网络图
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图4 药物成分-靶点-通路网络图
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2.5 GO功能与KEGG富集分析
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利用DAVID数据库对30个交集靶点基因做GO功能富集（P<0.01）和KEGG通路分析（P<0.01），得到GO分析相关条目221个、信号通路分析47条。GO富集分析主要包括：生物过程、细胞组成及分子功能。根据P值筛选出每个条目的前10条结果，在微生信平台建立三合一可视化柱状图（图5），其纵轴表示富集条目的数量，横轴反映条目名称。GT治疗AVF血管内膜增生，主要是异种生物分解代谢过程、外源性药物分解代谢过程、药物代谢过程、等离子体膜、质膜的组成部分、内质网膜、氧化还原酶活性、血红素结合、单氧酶活动等生物学过程。KEGG通路按P值筛选出前10个条目进行可视化（图6）。图6所示气泡图纵轴KEGG中关键通路名称，横轴反映通路的富集分数（P值）。气泡大小反映count值大小，面积越大表示count值越大，提示该通路包含的交集基因数越多；气泡颜色代表富集分数P值大小，颜色越红则P值越小，显著性就越大，说明本条通路与AVF内瘘处IH的相关性越高。按P值大小得到钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、化学致癌-受体激活、化学致癌-DNA加合物、药物代谢-细胞色素P450等通路与内瘘处IH相关性最强，其中钙信号通路是最重要的一条通路（图7），包括NTRK1、OXTR、ADRB3、NOS3、CHRNA7、ADRA1D、ADRB1和AVPR1A基因。将以上8个基因导入Cytoscape3.9.1软件中，按degree值由大到小依次为ADRB3、NOS3、ADRB1、OXTR、AVPR1A、CHRNA7、ADRA1D。其中ADRB3、NOS3、ADRB1度值最高，表明GT可能主要通过参与调控以上生物学基因对AVF血管内膜增生的起抑制作用。
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图5 GO富集分析柱状图
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图6 KEGG富集分析
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图7 钙信号通路图
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2.6 分子对接结果
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GT通过活性成分筛选及靶点预测后按LogkP值排序，选取前5位中的共同成分：（-）-Limonene、（-）-alpha-Pinene（肉桂、乳香共有）、Tridecnoic acid（地龙、没药共有）。结合PPI网络关键靶点和KEGG富集分析主要通路中的关键基因，得到NOS3为关键基因，应用AutoDock Vina软件将三个共同的化合物分别与NOS3蛋白（PDB: 1d0c）进行分子对接，筛选标准为结合能≤− 5.0 kcal/mol（表3）。NOS3蛋白与三个化合物成分结构均有较高的结合能力，并借助 PyMol 软件将对接结果可视化（图8），其中A图代表（-）-Limonene和NOS3蛋白的结合，B图代表（-）-alpha-Pinene和NOS3蛋白的结合，C图代表Tridecanoic acid和NOS3蛋白的结合。
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图8 分子对接结果图片
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3 讨论
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多数研究显示，内瘘处血管的炎症反应、血流剪切应力改变、内皮细胞功能障碍、氧化应激反应、血尿毒症毒素积累等是AVF静脉血管内膜增生主要病理因素[31-33]，最重要的因素是炎症反应[34]。静脉新生内膜增生（VNH）导致的A-V瘘管狭窄治疗措施有限。现VNH并发症治疗主要是经皮腔内血管成形术[35]。Lu等[36]为最大限度地保留长期HD患者血管，建立手术切除VNH并重新吻合动静脉的技术修复A-V瘘管。临床上AVF血管内膜增生导致的狭窄常反复发作，再次手术或者重新造瘘增加了病人身体、心理及经济压力，现有药物保守治疗措施又较少，治疗效果均为达到医生和患者预期目标，因此，寻求有效治疗AVF血管内膜增生的药物并研究其作用机制对于长期HD患者有重大意义。
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GT作为我院肾内科血透室长期治疗HD患者AVF血管内膜增生的经验用方，临床应用均有抑制内瘘处IH的作用，至今未发现其对患者有其他不良反应[8-10]。中医学中无“血管”一说，但在《素问·脉要精微论》有“夫脉者，血之府也”的记载，“脉”在此时主要表达“脉管”的概念，是容纳和运行血液的通道。《灵枢·经脉》[37]言：“经脉者，支而横者为络，络之别者为孙，络者，从脉逐层细分遍布全身”。这和现代医学血管解剖中的“大血管-中小血管-毛细血管及微循环”结构基本一致。《明医杂著》[38]描述“脉者，血之隧道也，血随气行，周流无停”。当下通过药理学的研究得出，GT方中肉桂所具有的肉桂醛成分有抗炎、抗感染的效果[39]；地龙可以减慢血液流变学、血流动力及抗血栓效果[40]；红花中的黄酮、生物碱及多糖等成分，有控制血流动力学、抗炎、抗氧化等药理效果[41-43]。乳香具有抗炎等效果[44]，没药所含的没药甾酮具有抗炎、降血脂、黏膜保护、镇痛等药理作用[45-46]。但GT等中药治疗AVF血管内膜增生机制的研究相对较少。
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本研究共筛选得到GT关键活性成分81个，按LogkP值排序前五位活性成分是：香叶甲、十三烷酸、柠檬烯、辛烷、α-三联噻吩，对81个活性成分进行靶点预测得到成分相关靶点576个（P>0.01），与疾病靶点取交集后得到共同关键靶点30个，说明GT治疗AVF血管内膜增生的药物靶向性较好，覆盖范围较广。通过PPI网络互作网络分析，得到ACE、PPARG、CXCL8、NOS3、MTOR、HMOX1、TGFB1等互作频次较高的基因。
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GO基因功能注释分析结果显示，差异基因最可能相关的生物途径主要集中异种生物分解代谢过程、外源性药物分解代谢过程、药物代谢过程、等离子体膜、质膜的组成部分、内质网膜、氧化还原酶活性、血红素结合、单氧酶活动等功能。
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KEGG通路富集分析结果提示，桂龙护瘘酊治疗AVF血管内膜增生与钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、化学致癌-受体激活、化学致癌-DNA加合物、药物代谢-细胞色素P450等多条通路相关性最强，其中钙信号通路是最重要的一条通路（图8），表明AVF血管内膜增生的相关机制中，多成分均参与作用，体现了中药多途径治疗特点，也体现了GT协同作用。
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Choi等[47]纳入114例接受AVF手术患者的动脉样本，以确定动脉微钙化，随访一年发现微钙化患者比无钙化患者的AVF通畅率低。Jankovic等[48]研究发现有AVF血管钙化患者的高脉搏波速度（pulse-wave velocity，PWV）并不比没有钙化的高，高剪切应力和反复穿刺可能是血管通路钙化先于大动脉钙化的重要因素。Lyu等[49]研究血管钙化标志物较低的胎球蛋白-A、较高的骨保护素（OPG）、骨形态发生蛋白-7（BMP-7）与AVF血管内膜增生有关。Chandra等[50]研究发现，血管内皮生长因子可通过抑制血小板衍生生长因子刺激的血管平滑肌细胞内钙释放，从而抑制血管平滑肌细胞增值，减轻血管内膜增生。谢娟等[51]观察了72例AVF术后使用GT外涂8周的患者，其AVF静脉血管扩张平均内径、动脉阻力指数、血管条件（弹性、震颤）优于对照组，GT外涂有效促进透析患者AVF成熟，降低内瘘功能成熟不良。程晓娟等[52]运用GT联合远红外线疗法改善AVF功能，发现远红外线联合GT外涂可显著降低AVF血管内皮厚度及内瘘不良事件的发生。谢娟等[53]研究发现，桂龙护瘘涂膜剂可通过调控AVF血管炎症状态，抑制腺嘌呤新西兰兔AVF血管内膜增生；观察了90例AVF术后运用桂龙护瘘涂膜剂患者的炎症指标，发现桂龙护瘘涂膜剂可通过抑制炎症反应，减轻AVF血管内膜、中膜增生，促进内瘘成熟[54]。黎常利等[55]对70例AVF术后运用桂龙护瘘方热敷的患者进行研究，发现桂龙护瘘方热敷治疗能调整内皮素、CO水平、减少内瘘头静脉内膜增生，提高头静脉VEGF、降低α-SMA的表达，改善内瘘血流量。谭学惠等[56]以92例慢性肾功能衰竭患者为研究对象，探讨局部外用桂龙护瘘涂膜剂对血液透析患者炎症因子及自体动静脉内瘘成熟状态的影响，发现局部外用桂龙护瘘涂膜剂可降低AVF血管阻力和厚度，改善血管条件，增加血流量，降低术后炎性反应，促进内瘘成熟。文献分析结果表明血管内钙异常诱导的钙信号通路是AVF血管内膜增生发生发展中的关键机制，在AVF术前和术后使用GT沿内瘘血管走行区域外涂，可降低内瘘处静脉血管内膜增生，扩张内瘘静脉内径，降低动脉阻力指数，增加内瘘局部血流量，降低术后血管内炎性反应，促进AVF成熟。本研究从网络药理学研究、分子对接验证结果及文献报道证实了GT通过调控钙信号通路相关靶基因的表达来抑制内瘘处IH，为AVF血管内膜增生的治疗提供了理论依据。
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综上所述，本研究通过网络药理学的方法，对AVF瘘管处局部外用中药复方防治内瘘处IH进行了新探索，筛选得到GT的活性成分及作用靶点，进一步预测其治疗AVF血管内膜增生的关键调控靶点与关键信号通路。并采用分子对接技术验证其结果，为GT药物治疗AVF血管内膜增生提供了（-）-Limonene、（-）-alpha-Pinene及Tridecnoic acid等多靶点；钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、化学致癌-受体激活多通路的作用特点，关键在于调控NOS3蛋白表达水平，为后续研究提供了理论依据。作者后期将在本篇文章及本课题组前期研究的基础上，开展相应动物实验、临床试验研究以及多中心临床应用数据研究，使桂龙护瘘酊可广泛推广使用。
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摘要
目的：基于网络药理学方法以及分子对接探讨桂龙护瘘酊（GT）治疗自体动静脉内瘘（AVF）血管内膜增生（IH）的作用机制。方法：本研究基于HERB数据库并查阅相关文献，筛选GT方中药物的活性成分，按Lipinsk五原则筛选有效成分，并使用PubChem数据库获取成分的Smile，再用Swiss TargetPrediction数据库预测成分靶点。利用GeneCards、Pharmgkb、OMIM数据库收集AVF血管内膜增生相关靶点。利用Venn在线网站得到GT-AVF血管内膜增生的交集靶点Venn图。利用String平台构建以药物、活性成分、潜在靶点的PPI网络，利用DAVID数据库中对其进行GO富集分析和KEGG信号通路分析，采用分子对接进行验证。结果：通过网络药理学研究，GT方中共获取到主要活性成分81个、关键成分预测靶点30个，应用PPI网络得到ACE、NOS3等关键交集靶点。富集分析后得到221个GO相关条目、47条相关KEGG信号通路，GO分析结果主要集中在异种生物分解代谢过程、外源性药物分解代谢过程等，KEGG富集分析关键通路是钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路等，关键靶点主要富集在ADRB3，NOS3，ADRB1等。分子对接显示(-)-Limonene、(-)-alpha-Pinene、Tridecnoic acid核心成分与NOS3蛋白(PDB: 1d0c)核心靶点具有非常好的结合构象。结论：本研究采用网络药理学与分子对接技术，为GT治疗AVF血管内膜增生提供了(-)-Limonene、(-)-alpha-Pinene及Tridecnoic acid等多靶点；钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路的作用特点，主要与调控NOS3蛋白表达水平有关，为后期进一步实验、临床研究提供了理论依据，也是对AVF瘘管处局部外用中药复方防治IH进行的新探索。
Abstract
Objective To explore the mechanism of guilong fistula protecting tincture (GT) in treating tunica intima hyperplasia (IH) of autogenous arteriovenous fistula (AVF) based on network pharmacology and molecular docking. Methods This study based on the HERB database and relevant literature review. The active ingredients of the drugs were screened in the GT formula and follow the Lipinsk five principles to screen the active ingredients. PubChem database was used to obtain the Smile of the components, and then Swiss TargetPrediction database was used to predict the target points of the components. Targets related to endovascular hyperplasia of AVF were collected by GeneCards, Pharmgkb and OMIM databases.Venn map of intersection target of GT-AVF tunica intima hyperplasia was obtained by Venn onlinewebsite. a PPI network with drugs, active ingredients, and potential targets was built using the String platform. DAVID database was used for GO enrichment analysis and KEGG signaling pathway analysis. The molecular docking was used for validation. Results Through online pharmacology research, GT obtained a total of 81 main active ingredients and 30 key ingredient prediction targets. PPI network was applied to obtain key intersection targets, such as ACE and NOS3. After enrichment analysis, 221 GO related entries and 47 related KEGG signaling pathways were obtained. The GO analysis results mainly focus on the processes of heterologous biodegradation and exogenous drug metabolism. The key pathways for KEGG enrichment analysis are calcium signaling pathways, neural active ligand receptor interaction pathways, etc. The key targets were mainly enriched in ADRB3, NOS3 and ADRB1 etc. Molecular docking shows that the core components of (-)-Limene, (-)-alpha Pinene and Tridecnoic acid have good binding conformations with the core target of NOS3 protein (PDB: 1d0c). Conclusion This study adopts network pharmacology and molecular docking technology. It provides multiple targets such as (-)-Limonene, (-)-alpha Pinene and Tridecnoic acid for GT to treat AVF tunica intima hyperplasia. The characteristics of the calcium signaling pathway and the neuroactive ligand receptor interaction pathway. Mainly related to regulating the expression level of NOS3 protein. This provides a theoretical basis for further experiments and clinical research in the later stage. It is also a new exploration for the prevention and treatment of IH by using local topical Chinese herbal formulas at the AVF fistula site.
