骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是中青年患者最常见的原发恶性骨肿瘤，其中位发病年龄仅为20岁^[1-2]。OS因其早期症状不明显且容易发生肺部转移而有较高的病死率，且预后不佳^[3]。随着医疗的进步，目前主流的针对OS的治疗方案是新辅助化疗联合手术的综合治疗方式，这已使患者的5年生存率得到质的飞跃^[4]，但手术的创伤、化疗的不良反应对患者而言仍然是个巨大的挑战。基于此，本研究拟寻找能抑制OS的中药，为其治疗提供更科学的方案。《本草新编》记载“蟾酥，去毒如神，以毒制毒也”。对蟾酥的现代研究也证实其有效成分具有广谱抗癌活性且作用高效，对肝癌、胃癌、膀胱癌等均具有很好的治疗效果^[5-6]，还有研究证实蟾酥可以调控OS细胞的迁移、侵袭及凋亡^[7-8]，但具体作用机制尚不明确。本研究拟采用人骨肉瘤细胞MG-63，观察蟾酥对其抑制作用并深入探讨作用机制，拟为骨肉瘤治疗提供科学的中医治疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养

人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞库，DMEM培养液购自美国HyClone公司，特级胎牛血清购于以色列BI公司，胰酶细胞消化液购于中国Biosharp公司。

1.1.2 主要仪器

LightCycler 480 Ⅱ荧光定量PCR仪（德国Roche公司），热循环仪（美国ThermoFisher公司），医用离心机（中国湘仪公司），凝胶成像系统（中国天能科技公司），研究级正置荧光显微镜（德国Zeiss公司），超纯水净化仪（美国PALL公司），电子天平（德国Sartorius公司）。

1.1.3 主要试剂及药物

整合素α4（美国proteintech公司，货号19676-1-AP），固定破膜剂（中国联科生物公司，货号GAS006），抗兔IgG抗体（美国CST公司，货号4412S），抗荧光淬灭封片剂（中国Solarbio公司，货号S2100），PCR反转录试剂盒（德国Roche公司，货号04379012001），RNA提取试剂（中国vazyme公司，货号R401-01），MEK5抗体、Nur77抗体、c-myc抗体、caspase-9抗体、整合素α4抗体（中国servicebio公司，货号GB11894、GB113748、GB11053-1、GB113749、GB11351），BCA蛋白浓度测定试剂盒（中国Solarbio公司，货号PC0020），XMD8-92（中国MCE公司，货号4418），MEK5过表达腺病毒（中国吉满公司，货号1967）。

1.2 方法

1.2.1 MG-63细胞培养及传代

将人成骨肉瘤MG63细胞培养于添加10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃、5% CO₂饱和湿度恒温培养箱中培养，细胞融合度达80％以上时，使用含0.02％EDTA的胰蛋白酶进行消化传代。收集处理后的MG-63细胞，以每孔2×10³的密度接种在96孔培养板中，待其生长至对数期时，加入实验药物干预24 h。

1.2.2 含药血清制备

蟾酥（按照2015版药典，蟾酥含量6.8；货号20170601）水溶液（1：1），由山东中医药大学附属医院中心实验室提供。选用20只新西兰大白兔（2.0～2.5 kg），随机分为含药血清组和无药血清组，每组10只。含药血清组分别给予蟾酥（蟾酥浓度分别为2.5%、5%）水溶液，每日6 mL／kg体重剂量灌胃；无药血清制备组给予等剂量的生理盐水灌胃。每天2次，连续3 d，并于最后一次灌胃1 h后，穿刺心脏抽血。4℃冰箱过夜，离心，无菌分离血清，灭活后，-20℃保存备用。两组兔均自由进食和饮水。

1.2.3 qPCR法检测c-myc、caspase-9表达水平

PBS清洗一次后，每10 cm²培养面积的细胞加入1 mL RNA 提取试剂。将裂解液转移至1.5 mL离心管中，用移液器反复吹打，冰上静置5 min，使用Nanodrop 2000检测各组RNA浓度。根据反转录试剂盒使用说明进行逆转录并使用LightCycler 480 Ⅱ型 PCR仪进行扩增和检测。使用20 μL反应体系。反应完成后采集数据并统计分析。

1.2.4 免疫荧光法检测整合素α4

收集细胞悬液中的悬浮细胞放入PBS中清洗1~2次，加入100μL 4%多聚甲醛进行固定，后加入100 μL 0.2% Triton-100液进行穿透，室温孵育10 min。加入100 μL 5%BSA封闭液，室温孵育1 h。分别加入100 μL的一抗和二抗，4℃孵育过夜，100 μL的DAPI及抗荧光淬灭封片剂，置于正置荧光显微镜下荧光检测。

1.2.5 Western Blot法检测MEK5、Nur77、c-myc、caspase-9、整合素α4

弃掉培养基并用PBS清洗，加入蛋白裂解液不断吹打置于冰上裂解，提取总蛋白，测定蛋白浓度。照比例加入5×蛋白上样缓冲液后沸水加热3 min制作上样液。加样后行SDS-PAGE 电泳，转膜至PVDF膜，脱脂奶粉溶液中室温摇床封闭1 h后加入MEK5、Nur77、c-myc、caspase-9、整合素α4一抗（1：1 000，1：1 000，1：1 000，1：5 000），4℃ 过夜，再加入二抗（1：10 000）室温孵育后显影，用Image J软件进行灰度值分析。

1.2.6 统计学分析

应用SPSS 24.0软件进行统计学分析，计量数据以$\stackrel{-}{x}\pm s$表示，先对各组数据进行正态性检验及方差齐性检验。符合正态分布且方差齐者采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蟾酥抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖、转移并促进细胞凋亡

相较于空白对照组，蟾酥含药血清干预后c-myc的mRNA表达下降而caspase-9的mRNA表达上升（P<0.05），且蟾酥含药血清浓度越高，c-myc含量越低而caspase-9含量越高，即蟾酥含药血清浓度与c-myc的表达呈负相关，而与caspase-9表达呈正相关（图1）。免疫荧光法检测各组整合素α4的表达情况结果显示，细胞被标记为蓝色，整合素α4被标记为绿色，与对照组相比，蟾酥含药血清干预后细胞中整合素α4表达显著下降，且与含药血清浓度呈负相关（图2）。

2.2 蟾酥对ERK5通路的作用效应

Western Blot检测各组MEK5、Nur77的表达情况发现，蟾酥含药血清干预后各组ERK5信号通路分子MEK5、Nur77的表达下调（P<0.05），且与蟾酥含药血清浓度呈负相关（图3）。

2.3 应用XMD8-92及过表达MEK5腺病毒后对c-myc、caspase-9、整合素α4表达影响

与空白对照组相比，XMD8-92组与5%含药血清组的caspase-9表达升高，整合素α4及c-myc表达下降（P<0.05）；相较于5%蟾酥含药血清组，XMD8-92联用5%蟾酥含药血清组具有更高的caspase-9表达水平及更低的整合素α4及c-myc表达水平，见表1。相较于5%含药血清组，5%含药血清+MEK5过表达腺病毒组c-myc、整合素α4表达上调，而caspase-9表达下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

注：^a与空白对照组比较，P<0.05；^b与5%含药血清组比较，P<0.05

注：^a与空白对照组比较，P<0.05；^b与5%含药血清组比较，P<0.05

3 讨论

OS是以非典型性疼痛、肿胀为早期症状的原发恶性肿瘤，青少年人群中最为常见^[2]。因其早期症状常与青少年的生长痛相混淆而难以早期发现，延误治疗，且OS具有局部复发率高，容易发生频繁全身转移（特别是肺部转移）的特点，故长期存活率较低^[9-10]。目前对OS的治疗方案中截肢或保肢外科手术治疗占有重要地位^[11]；除手术外，新辅助化疗也是常用的治疗方式，研究证实新辅助化疗对缩小肿瘤外科边界、提高生存率具有重要意义^[12]。但外科手术和化疗的直接创伤和副作用往往令患者难以接受，所以在中医药这个瑰宝中搜寻有效的治疗骨肉瘤的方案具有重要意义。

蟾酥，味甘、辛、性温，具有开窍醒神、清热解毒的功效，《本草新编》记载“蟾酥，去毒如神，以毒制毒也。消坚破块，解瘀化痈。虽皆外治之功，而药笼中断不可缺”。现代中医肿瘤理论体系认为OS的发生发展与“癌毒”关系密切，即“癌毒”入经络、血脉向远处播散，故导致肿瘤的转移^[13]。正是基于“癌毒”理论，中医大家多从“清热解毒、化瘀消肿”的角度治疗OS，疗效颇佳^[14]。在“解毒抗癌”理念的指导下，从“解毒类”中药中挖掘抑制OS的有效成分已成为研究热点。

蟾酥中化学成分除外蟾蜍内脂类、蟾蜍色胺类和甾醇类三大类，尚含有氨基酸、有机酸、肾上腺素、吗啡、多肽、多糖等化合物^[15]，蟾蜍色胺类化合物含有吲哚环的吲哚碱类，具有抗肿瘤和血管收缩作用^[16]。蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾毒精是蟾酥抗肿瘤作用的主要活性成分。蟾毒灵已被证实具有广谱抗癌、作用高效的特点^[6]，华蟾毒精可治疗如肝癌、乳腺癌等多种肿瘤疾病^[17-19]。其他学者已对蟾酥的有效成分进行研究，发现其具有可以抑制OS的迁移、侵袭^[20]并诱导细胞凋亡的作用效果，但其作用机制研究尚不深入。

基于此，本研究采用蟾酥含药血清干预人骨肉瘤细胞MG-63，研究蟾酥的作用效应并探索其深层作用机制。细胞增殖受到各种分子信号调控，研究证实癌基因c-myc对人成骨肉瘤细胞分化具有诱导作用^[21]。此外，细胞凋亡是机体为调控自身的生长发育，维护其内部环境的稳定，由自身基因控制的细胞主动死亡的过程。细胞凋亡是药物杀伤肿瘤细胞的重要机制。caspase-9在促进细胞凋亡的过程中起到了重要作用，其表达具有促进细胞凋亡的作用。刘国雄等^[22]通过实验证实人成骨肉瘤MG-63细胞的凋亡作用和caspase-9有关。骨肉瘤极易转移，这与一些促进转移的分子被启动有关，国内研究者早就通过实验说明整合素α4对MG-63细胞的恶性转移能力有明显的诱导作用，抑制整合素α4有助于控制MG-63细胞的转移功能^[23]。研究结果显示，蟾酥含药血清干预后，c-myc、整合素α4表达下调而caspase-9表达升高，且在一定范围内，蟾酥含药血清浓度越高，作用效果越好。本次实验证实蟾酥含药血清能够显著抑制OS的作用，且随着浓度的提高，这种作用效应也在增强。但蟾酥含药血清浓度高于5%时，这种作用是否也会随着浓度的升高而强化，是下一步研究的重心。以上数据表明蟾酥可以发挥抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖、转移并促进细胞凋亡的作用效应。

对ERK5信号通路相关指标进行检测发现，蟾酥含药血清干预后MEK5、Nur77含量下调，与浓度呈负相关性，这表明蟾酥的作用效应可能与抑制ERK5通路相关。为进一步证实蟾酥调控ERK5发挥相应作用机制，本研究采用ERK5的抑制剂XMD8-92及MEK5过表达腺病毒进行实验，结果显示XMD8-92的作用效应与蟾酥相同，而MEK5过表达后蟾酥的作用效应被拮抗，过表达MEK5腺病毒的空载体不具备作用效应，这证明了蟾酥通过抑制ERK5信号通路发挥相关作用。

综上，蟾酥具有抑制OS的作用效应，并且其通过阻断ERK5信号通路发挥抑制MG-63细胞增殖、转移并促进细胞凋亡的作用效果，随着对蟾酥抑制OS研究的不断深入，能为OS的防治提供更好的方案。

参考文献